¿ES LA PEGILACIÓN LA SOLUCIÓN AL USO DEL ANTICUERPO RECOMBINANTE FABC11: STX2 PARA NEUTRALIZAR LA TOXINA SHIGA IN VIVO?

HENRIQUE IM; SACERDOTI FLAVIA; AMARAL MARÍA M; PALERMO MARINA S; IBARRA CRISTINA; LUZ DANIELA; PIAZZA ROXANE M F

Buenos Aires

Simposio; PRIMER SIMPOSIO ARGENTINO DE ESCHERICHIA COLI PRODUCTOR DE TOXINA SHIGA RESPONSABLE DEL SÍNDROME URÉMICO HEMOLÍTICO; 2022

Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), Facultad de Medicina-UBA, Asociación Argentina de Microbiología (AAM), Asociación Civil ?Lucha contra el Síndrome Urémico Hemolítico? (LuSUH).

Los anticuerpos se utilizan como herramientas terapéuticas en la clínica desde hace varias décadas. Actualmente, no existe un consenso sobre el tratamiento para la intoxicación por toxina Shiga (Stx) y la utilización de anticuerpos para ello tiene una perspectiva interesante para investigar. En este sentido, la administración de IgG completa puede impedir la llegada de este biofármaco a los tejidos y causar efectos adversos por la porción cristalizable (Fc). La utilización del fragmento Fab sólo resuelve estos efectos, pero en contraparte, reduce significativamente la vida media del producto biofarmacéutico en el cuerpo de aproximadamente 7-21 días a 0,3-1 hs. Previamente demostramos que FabC11:Stx2, generado por la tecnología phage display neutralizó el efecto de las toxinas (Stx1 y Stx2), e inhibió hasta en un 100% la citotoxicidad en células epiteliales y endoteliales renales. Sin embargo, en estudios in vivo, protegió a los ratones sólo cuando se coincubó con Stx2. La hipótesis que planteamos es que aumentar la vida media del fragmento permite potenciar su acción in vivo. Para ello proponemos mejorar las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de la molécula a través de la pegilación, que confiere, además, una mejora en la hidrodinámica, un aumento en la estabilidad y una disminución en la inmunogenicidad. En el presente estudio, se seleccionó el diseño de pegilación por lisinas y cisteínas disponibles para la unión Fab-PEG. El análisis in silico de Fab por el software Pymol, mostró la presencia de una sola cisteína libre para la conjugación. La reacción específica del sitio se realizó con PEG maleimida de 20 y 40 kDa en proporción 1:15 (Fab:PEG) y se redujo con tris (2-carboxietil)fosfina (TCEP) en proporción 1:20 (Fab:TCEP) y se purificó FabC11:Stx2-PEG por cromatografía de exclusión molecular. Dado que la conjugación proporciona una disminución en el rendimiento final del bioproducto y ya que este fragmento de anticuerpo recombinante se produce en E. coli BL21, en el presente trabajo propusimos optimizar el cultivo bacteriano para mejorar su obtención. Para ello, se cultivaron las bacterias variando los siguientes parámetros: composición nutricional [(medios de cultivo 2YT, caldo lisogénico (LB) y caldo Terrific (TB)], fuentes de carbono (glucosa y glicerol) y temperatura post-inducción (25°C y 37°C). Se observó una mayor tendencia a la multiplicación celular en el medio TB y a 25°C en relación al 2YT y que el uso de fuentes mixtas de carbono (glicerol y glucosa) es similar a las pruebas que usan solo glucosa a 25°C. Por SDS /PAGE se observó un componente de masa molecular relativa de 150 kDa referente al FabC11:Stx2-PEG y la reactividad de esta molécula contra Stx2 fue similar al Fab nativo evaluado por ELISA. En este trabajo se seleccionó el diseño de pegilación específico del sitio, se optimizaron los parámetros de crecimiento bacteriano y los resultados preliminares de los análisis in vitro mostraron buena reactividad de FabC11:Stx2-PEG contra Stx. Proponemos que FabC11:Stx2-PEG puede ser una buena herramienta y un futuro tratamiento para la neutralización de la toxina Shiga in vivo