Construcción y Generación de vectores vacuanales portando antígenos del Virus de la Inmunodeficiencia Humana del subtipo B y la Forma Recombinante Circulante en Argentina CRF_12

ANA MARÍA RODRIGUEZ; DANIELA MÓNACO; MAURICIO CAROBENE; GABRIELA TURK; HORACIO SALOMÓN; M.MAGDALENA GHERARDI

Vaquerias, Valle Hermoso-Córdoba

Congreso; XXVI Reunión Científica Anual de Virología; 2006

Sociedad Argentina de Virología

El Síndrome de la Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) es una de las enfermedades infecciosas con mayor impacto en el mundo, por lo tanto una vacuna efectiva y segura sería una de las mejores herramientas para controlar la pandemia. Los poxvirus se utilizan eficientemente como vectores para la expresión de genes foráneos y para la construcción de vacunas contra enfermedades infecciosas. A su vez, dichos vectores son altamente efectivos para incrementar respuestas inmunes celulares inducidas previamente con un vector heterólogo (como ADN), estrategia de inmunización conocida como “Prime-Boost”. El objetivo de nuestro trabajo es el desarrollo de reactivos biológicos para analizar la importancia de la inmunidad celular subtipo específica en el desarrollo de estrategias de vacunación frente a HIV-1 en nuestra región. Para tal fin, evaluaremos la inmunogenicidad de antígenos de la forma recombinante circulante BF (CRF12_BF) del Virus de la Inmunodeficiencia Humana tipo 1 (HIV-1) y la reactividad cruzada con antígenos del subtipo B, ambos prevalentes en Argentina. En este trabajo se presenta la generación de vectores de ADN de expresión eucariota y la obtención de virus Vaccinia recombinantes (VVr) obtenidos en la cepa Western Reserve. Ambos tipos de vectores portan las secuencias codificantes para la proteína Nef (B y B/F) y el gen sintético codificante para la proteína Env B/F (syn EnvB/F). Los vectores ADN se obtuvieron utilizando un vector comercial y las secuencias de los genes de interés amplificados por PCR a partir del genoma viral de HIV-1, las que están en el vector bajo la regulación del promotor constitutivo de Citomegalovirus. La correcta expresión de las proteínas recombinantes se evaluó mediante la técnica de Western Blot (WB) luego de la transfección in vitro de células 293-T.  Los poxvirus recombinantes se obtienen por recombinación homóloga entre el genoma viral y un vector de transferencia (VT) que porta el gen de interés bajo un promotor viral, flanqueado por regiones genómicas virales  no esenciales, promotoras de la recombinación. En este caso hemos utilizado el VT pJR101, que lleva secuencias homólogas al gen de la hemaglutinina viral en donde se quiere insertar el gen de interés y el gen reportero de ß-Glucoronidasa (ß-Gluc). Este último permite la detección de los virus recombinantes.  La generación de los VVr se realizó mediante la infección-transfección a  baja multiplicidad de infección, tras lo cual a las 48 hs post infección se obtuvo una mezcla de virus recombinante y salvaje. La purificación de los clones se realizó tras varias rondas de infección y selección de las placas positivas para ß-gluc (5 a 7 rondas).  La pureza de los VVr se verificó al obtener una cantidad equivalente de unidades formadoras de placas (UFP) ya sea por la tinción con cristal violeta o por la aparición de UFP azules tras la adición del sustrato específico para ß-Gluc. También se verificó la pureza mediante una PCR específica para el gen de la hemaglutinina. CONCLUSIÓN: En este trabajo se muestra la obtención de los vectores de DNA de expresión eucariota y la generación de los VVr que se utilizarán en ensayos in vivo en ratones.  Ésta es una primera aproximación en el desarrollo de inmunógenos para HIV empleando antígenos de subtipos circulantes en Argentina y países limítrofes.