Expresión de la isoforma tipo I de la enzima 11beta-Hidroxiesteroide Deshidrogenasa en el ovario bovino.

AYELEN AMWEG; NATALIA ALFARO

Santa Fe

Encuentro; XII Encuentro de Jóvenes Investigadores de la Universidad Nacional del Litoral y II Encuentro de Jóvenes Investigadores de Universidades de Santa Fe; 2008

INTRODUCCIONLos glucocorticoides actúan directamente sobre las células ováricas inhibiendo la acción de las gonadotrofinas y la síntesis de esteroides. Estas acciones de los glucocorticoides (cortisol y corticosterona) son reguladas por isoformas de la enzima 11beta-hidroxiesteroide dehidrogenasa (11beta-HSD). Dos isoformas de la 11beta-HSD han sido clonadas: 11beta-HSD-1 actúa predominantemente como una reductasa NADP(H) dependiente para generar cortisol activo o corticosterona, y 11beta-HSD-2 es una enzima NAD+ dependiente de alta afinidad que cataliza la inactivación enzimática de los glucocorticoides.Se han determinado en algunas especies, las bases moleculares de la actividad de 11beta-HSD-1 durante la luteinización, concluyendo que la sobreexpresión de  esta enzima en el momento de la ovulación es inducida por las gonadotrofinas. Como la ovulación es un evento inflamatorio, caracterizado por un incremento en la síntesis de interleuquinas y prostaglandinas, la generación incrementada de glucocorticoides antiinflamatorios por la actividad de la 11beta-HSD-1 en el momento de la ovulación, podría representar un mecanismo fisiológico para limitar el proceso inflamatorio en el ovario. En este sentido, se ha demostrado que los glucocorticoides inhiben la síntesis de prostaglandinas y citoquinas pro-inflamatorias en el ovario. Debido a que la expresión de 11beta-HSD-1 es estimulada en las células de la granulosa por la LH y por citoquinas pro-inflamatorias, la síntesis de glucocorticoides vía 11beta-HSD-1 podría ser incrementada por las gonadotrofinas y/o citoquinas, como un aspecto integral de la cascada de la ovulación.OBJETIVOSEl objetivo del presente trabajo fue identificar la expresión de la  isoforma tipo I de la enzima 11beta-HSD en folículos ováricos bovinos a través de la técnica reacción en cadena de la Polimerasa (PCR).MATERIALES Y MÉTODOSBasados en secuencias ya publicadas y utilizadas para la amplificación de fragmentos de ARNm correspondientes a 11beta-HSD-1, se diseñaron tres pares de  primers específicos para distintos fragmentos de la secuencia de la enzima. Se realizó un estudio de las secuencias seleccionadas utilizando las herramientas disponibles online en la página web del National Center for Biotechnology Information a fin de evitar amplificaciones inespecíficas a partir de ADN genómico. La especificidad de todos los primers fue cotejada por comparación directa de su secuencia contra el genoma completo de Bos Taurus mediante el uso de la herramienta BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).En el aislamiento y purificación de ARN total a partir de tejido congelado se utilizó un homogeneizador Ultra Turrax® T25 Basic para dispersar los tejidos ováricos obtenidos directamente de animales en frigorífico. Para el aislamiento del ARN total se utilizó la técnica de extracción por fenol-cloroformo-alcohol isopropílico, seguida por lectura espectrofotométrica a 260 nm para su cuantificación. La integridad física del ARN extraído se constató a través de la visualización de las bandas correspondientes a los ARNr en geles de agarosa con formaldehído. Las corridas se realizaron en cuba de electroforesis horizontal Bio-Rad Power Pac 300 manteniendo el voltaje constante a 60V y se revelaron los geles en un transiluminador Dyne Light (Labnet).En el paso de la transcripción reversa se utilizó la enzima Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase (MMLV-RT, Promega), usando como primers hexanucleótidos con secuencias al azar.  La reacción en cadena de la polimerasa se llevó a cabo en un termociclador Techne TC312 utilizando la enzima Taq polimerasa. Se utilizó MgCL2 3mM. Se realizó una desnaturalización de templado 94°C por 3 min., seguido por 30 ciclos en los que se realizó desnaturalización a 94°C por 45seg., anillado a la temperatura óptima para cada primer (tabla) por 30seg. y elongación a 72°C por 1min 30seg. Se utilizó el método semicuantitativo descripto por Thurston et al. (2007). Para normalizar los resultados obtenidos se incluyó en la RT-PCR un gen de expresión constitutiva como lo es la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenada (GAPDH) y los resultados fueron expresados como la razón entre el gen específico y el constitutivo.RESULTADOSLa RT-PCR  de los cDNA preparados a partir células ováricas bovinas usando los primers 11beta-HSD-1(1), 11beta-HSD-1(2) y 11beta-HSD-1(3) generaron amplificaciones de 491pb, 505pb y 575pb, repectivamente, correspondientes con la longitud esperada del fragmento amplificado. Esto demuestra la presencia de RNAm correspondiente a la enzima 11beta-HSD-1 en las muestras analizadas.CONCLUSIONBasados en estos resultados podríamos inferir que la activación local del cortisol por la 11beta-HSD-1 en los folículos ováricos bovinos podría cumplir funciones importantes en la regulación de la función ovárica. Considerando que la ovulación se trata de un proceso inflamatorio mediado por interleuquinas y prostaglandinas, su participación podría ser crucial en la patogenia de enfermedades que cursan con anovulación.