Aspiración folicular guiada por ecografía de quistes ováricos bovinos, para la purificación de ARN total a partir de dichas muestras

DÍAZ, PABLO U.; VELAZQUEZ, MELISA M.; STANGAFERRO, MATÍAS L.; BERTOLI, JOSÉ; PANZANI, CAROLINA G.; AMWEG, AYELEN N.; SALVETTI, NATALIA R.; ORTEGA, HUGO H.

Jornada; XII Jornadas de Divulgación Técnico Científicas, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNR. Joranda Nacional de Divulgación Técnico Científica 2011 UNR-UNL; 2011

La enfermedad quística ovárica se caracteriza por la presencia de estructuras foliculares persistentes en el ovario, asociadas con anovulación, infertilidad, y anestro en vacas; que ocasiona cuantiosas pérdidas económicas. Por esta razón, ha sido estudiada extensamente en relación a su diagnóstico y tratamiento, sin embargo, en la actualidad es exigua la información acerca de los mecanismos causantes de su desarrollo. Por otra parte, aunque diversos estudios han caracterizado la dinámica del crecimiento folicular, aún son escasos los conocimientos de las modificaciones celulares y moleculares ocurridas en el folículo ovárico previo al proceso de anovulación, ya que la mayoría de los estudios están realizados sobre casos crónicos y muestras obtenidas en frigorífico. Es por ello que un diagnóstico precoz de casos a campo basado en el hallazgo de estructuras foliculares mayores a 20 mm, en ausencia de CL y con pérdida de tono uterino. Permitiría hacer un seguimiento de la enfermedad, obteniendo material previo al tratamiento que permita el estudio de los posibles mecanismos etiopatogénicos de la misma. En el presente estudio, se propone extraer ARN total de células de la granulosa, a partir de muestras obtenidas por aspiración folicular de quistes ováricos bovinos. Para ello se utilizó un sistema de ultrasonido digital Chison 8300vet equipado con un transductor microconvexo de 5,0 MHz montado en una sonda transvaginal para aspiración folicular (Watanabe Tecnología Aplicada Ltda., Cravinhos, Brasil). La misma posee una guía para la colocación de una aguja calibre 20G con bisel ecogénico que se conecta por medio de una tubuladura de teflón a tubos contenedores cónicos estériles de 50ml. Para la aspiración se empleó una bomba de vacío a una presión de aspiración de 500mm Hg. Se utilizaron 5 vacas raza Holando Argentino en lactancia con Enfermedad Quística Ovárica diagnosticada por ecografía. Una vez que el dispositivo de aspiración fue montado, éste fue introducido vía vaginal hasta contactar con el fondo de la misma, el quiste folicular fue localizado por tacto rectal, acercado y fijado al transductor de la sonda. Una vez visualizado, se procedió a la introducción de la aguja a través de la pared vaginal y luego a través de la pared del quiste para la toma de muestra, al mismo tiempo que la bomba de vacío fue activada. Inmediatamente luego de la recolección del líquido folicular rico en células de la granulosa, se procedió a su conservación a temperatura de refrigeración (4-6ºC) y se trasladó al laboratorio. El volumen total de la muestra se dividió en alícuotas de 1,5ml en crioviales estériles. Se centrifugaron, se retiró el sobrenadante y a cada tubo con el precipitado celular se le adicionaron 750ul de Trizol, conservándose en nitrógeno líquido. Al momento de la extracción del ARN, se descongelaron las muestras y se homogeneizó cada uno de los pellet. El ARN total se extrajo a partir del sobrenadante obtenido con cloroformo y posterior precipitación con alcohol isopropílico, a -20ºC. El ARN obtenido se lavó con etanol 75%, se redisolvió con agua DEPC (0,1%) y se cuantificó por espectrofotometría a 260nm.  A los efectos de eliminar posibles contaminaciones de ADN genómico, se realizó un tratamiento con ADNasa. Para la transcripción reversa primeramente se preparó una solución conteniendo cebadores con secuencia al azar, dNTPs, buffer de la enzima MMLV, DTT, ARNasaOut y la enzima MMLV Transcriptasa Reversa, además de una cantidad constante de ARN tratado con ADNasa. Todas las reacciones se llevaron a cabo en termociclador convencional. Posteriormente la concentración de ADN copia (ADNc) obtenida fue cuantificada por un método fluorimétrico (QubitTM, Invitrogen) con el objeto de utilizar luego una cantidad constante para la técnica de amplificación del ADN (PCR). Finalmente y para comprobar la eficacia de la extracción inicial del ARN a partir de células granulosas obtenidas por aspirado folicular, se realizó la amplificación específica de la secuencia codificante para la enzima CYP19 (Cytochrome P450, aromatasa), cuya actividad y localización es específica de este tipo celular en el folículo, empleando como molde el ADNc total. Los resultados demostraron que es posible la extracción de ARN total de  células de la granulosa obtenidas por aspiración folicular de quistes diagnosticados a campo, y que dichas muestras son viables de ser procesadas luego de su conservación con Trizol en nitrógeno líquido. De esta manera, el material obtenido por estos medios, haría posible el estudio de alguno de los mecanismos etiopatogénicos de la enfermedad, teniendo en cuenta que se puede obtener una anamnesis completa de estos casos a campo y conocer algunos factores que pudieron haber influenciado en el trastorno anovulatorio.