INVESTIGADORES
AMWEG Ayelen Noelia
congresos y reuniones científicas
Título:
Identificación de células de la granulosa y tecas por PCR en Tiempo Real, en muestras de células obtenidas por aspiración folicular
Autor/es:
DÍAZ, PABLO U.; AMWEG, AYELEN N.; RODRIGUEZ, FERNANDA M.; STANGAFERRO, MATÍAS L.; BERTOLI, JOSÉ; PANZANI, CAROLINA G.; REY, FLORENCIA; SALVETTI, NATALIA R.; ORTEGA, HUGO H.
Reunión:
Congreso; IX Simposio Internacional de Reproducción Animal; 2011
Resumen:
La
enfermedad quística ovárica ha sido estudiada extensamente en relación a su
diagnóstico y tratamiento, sin embargo, en la actualidad es exigua la
información acerca de las modificaciones celulares y moleculares ocurridas en
el folículo previo al proceso de anovulación. Esto se debe a la dificultad de
obtener muestras de tejido ovárico de animales en producción. Diversos estudios
han sido realizados sobre casos crónicos y muestras obtenidas en frigorífico
que no siempre representan la realidad de los casos a campo. Basados en estos
antecedentes, nos propusimos obtener, mediante aspirado folicular guiado por
ultrasonografía, muestras de quistes foliculares, que permitan la realización
de técnicas de Biología Molecular. Para el diagnóstico de los quistes se
consideraron estructuras mayores a 18 mm, en ausencia de cuerpo lúteo y con
pérdida de tono uterino. Particularmente, caracterizamos la población celular
de los aspirados, mediante el análisis de la expresión del ARNm de la enzima
CYP19A1 (Aromatasa) propia de las células de la granulosa y de la enzima
CYP17A1 (17alfa-Hidroxilasa) presente en células de la teca. Para el aspirado
folicular se utilizó un sistema de
ultrasonido digital Chison 8300vet equipado con un transductor microconvexo de
5,0 MHz montado en una sonda transvaginal (Watanabe Tecnología Aplicada Ltda.,
Cravinhos, Brasil). La misma posee una guía para la colocación de una aguja
calibre 20G con bisel ecogénico que se conecta por medio de una tubuladura de
teflón a tubos contenedores cónicos estériles de 50ml. El aspirado se realizó
empleando una bomba de vacío a una presión de 500mm Hg. Se utilizaron 10 vacas
raza Holando Argentino en lactancia con Enfermedad Quística Ovárica
diagnosticada por ecografía. Una vez que el dispositivo de aspiración fue
montado, se introdujo vía vaginal hasta contactar con el fondo de la misma. El
quiste folicular fue localizado por tacto rectal, acercado y fijado al
transductor de la sonda. Una vez visualizado, se procedió a la introducción de
la aguja a través de la pared vaginal y luego a través de la pared del quiste
para la toma de muestra, al mismo tiempo que la bomba de vacío fue activada.
Inmediatamente luego de la recolección del líquido folicular rico en células de
la granulosa, se procedió a su conservación a temperatura de refrigeración
(4-6ºC) y se trasladó al laboratorio. El ARNm se extrajo mediante la técnica de
Trizol, eliminando posibles contaminaciones de ADN genómico con ADNasa. Se
realizó la transcripción reversa con la enzima MMLV Transcriptasa Reversa en un
termociclador convencional. El ADN copia
obtenido fue sometido a la técnica de PCR en tiempo real (Real Time PCR)
en un termociclador Step One (Applied Biosystem) utilizando primers específicos
para las enzimas CYP19A1 y CYP17A1, determinando la expresión de ambas enzimas
en todas las muestras obtenidas. Los resultados demostraron que mediante la
técnica de aspirado folicular, es posible obtener células de teca y granulosa
para realizar estudios de biología molecular para la identificación de
transcriptos de genes específicos. De esta manera, mediante la técnica de
aspirado, sería posible el estudio de mecanismos etiopatogénicos de la
enfermedad, teniendo en cuenta que se puede obtener una anamnesis completa de
estos casos a campo y conocer algunos factores que pudieron haber influenciado
en el trastorno anovulatorio.