Caracterización de una línea de Macrófagos Bovinos (BoMAc) para su uso en estudios de fisiopatología de la reproducción en bovinos.

ETCHEVERS, L; CATTANEO, ML; RENNA, MS; AMWEG, AN; ORTEGA, HH; REY, F; SALVETTI, NR; STASSI, AF

Jornada; IX Jornada de Difusión de la Investigación y Extensión de la Facultad de Ciencias Veterinarias, UNL; 2021

El sistema inmune contribuye a la regulación de la función ovárica y participa en diferentes eventos dentro del folículo ovárico, incluyendo la maduración del ovocito, la ovulación, la fertilización, y otros. Las células inmunes desempeñan un papel integral afectando el éxito de la función reproductiva. De hecho, una disfunción inmune ha sido identificada como uno de los mecanismos principales relacionados a la infertilidad1. Particularmente, los macrófagos son derivados de monocitos circulantes que migran hacia los tejidos atraídos por el factor estimulante de colonias-1 (CSF-1) y la proteína quimioatrayente de monocitos-1 (MCP-1) producidos por células parenquimatosas en respuesta a la estimulación hormonal. Son las células inmunitarias más abundantes dentro del ovario, se han localizado en la teca de folículos en desarrollo y atrésicos en tejidos lúteo e intersticial, tanto en animales como en humanos. Su distribución fluctúa a lo largo del ciclo ovárico con los números más altos presentes en el proestro y el diestro, indicando la marcada influencia de las hormonas en la cinética de reclutamiento de los macrófagos al ovario2. Estas células inmunes son importantes para la función reproductiva normal debido a que están en contacto con otras células e influyen en sus funciones a través de la producción de citoquinas, factores de crecimiento, etc.3.Muchos trabajos utilizan monocitos aislados de sangre periférica para realizar experimentos in vitro para evaluar la actividad de macrófagos. Sin embargo, hemos comprobado al igual que otros autores4, que esta técnica tiene ciertas desventajas debido a que la purificación de monocitos de la población de células mononucleares es algo laboriosa y que la función de estas células depende del estado de los donantes en el momento de la extracción de sangre. Por lo tanto, utilizar este modelo experimental para evaluar funcionalidad de macrófagos puede plantear un problema real. Estos hechos nos llevaron a la búsqueda de una línea celular que reemplace el uso de estas células derivadas de monocitos. Un grupo de investigadores desarrollaron una línea celular de macrófagos bovinos (BoMac) derivados de macrófagos peritoneales4. Este grupo de trabajo realizó una amplia caracterización de esta línea BoMac en lo referente a capacidad fagocítica, citotoxicidad celular (dependiente e independiente de anticuerpos), producción de radicales de oxígeno y producción de IL-6 en respuesta a un estímulo activador4. En nuestro grupo de trabajo, nos planteamos el estudio in vitro de la interacción de las células de la granulosa bovina (línea celular BGC-1) con las células BoMac, para evaluar la interacción del sistema inmune con células propias del ovario. A su vez, para estos ensayos in vitro, tenemos planteados diversos estímulos hormonales, y para poder llevarlos a cabo evaluamos la expresión de los receptores de las hormonas de interés en las BoMac para su uso posterior. Es por todo lo descripto que nos planteamos como objetivo de este trabajo caracterizar en las células BoMac la expresión de los siguientes receptores: receptor de glucocorticoides (GR), receptor 2 de melanocortinas (MC2R), receptor de estrógenos a (ERa), receptor de estrógenos b (ERb) y receptor de progesterona (PR). Para llevar a cabo este objetivo sembramos las células BoMac en botellas de 25 cm2 a una concentración de 200.000 células/ml en medio completo (RPMI 1640 (Gibco, Thermo Fisher Scientific), L-glutamina 2 mM, suero bovino fetal al 10%, antibiótico-antimicótico 1X). A continuación, incubamos a 37°C en una atmósfera humidificada con CO2 al 5%. Una vez en confluencia, las células fueron removidas de las botellas raspando las mismas con un scraper. Luego se realizó el recuento celular en cámara de Neubauer con el colorante de exclusión azul de Tripán para conocer la concentración celular. Posteriormente, las células fueron centrifugadas durante 10 minutos (min) a 800 g, y el pellet celular fue resuspendido en buffer fosfato salino (PBS) 1X de manera tal de obtener una concentración celular de 500.000 células/ml. Seguidamente la suspensión celular fue citocentrifugada utilizando la citocentrífuga Cyto-Tek Sakura, los portaobjetos (50.000 células/portaobjetos) fueron almacenados a -20°C hasta la realización de la técnica de inmunocitoquímica indirecta para la detección de los receptores hormonales previamente mencionados. Brevemente, los portaobjetos conteniendo las células se fijaron en metanol frío y luego se permeabilizaron con tritón X-100 0,2% durante 10 min. A continuación, se incubaron con el anticuerpo primario (ver tabla) durante toda la noche a 4 °C. Como control negativo se omitió el anticuerpo primario, realizándose la incubación con PBS-albúmina sérica bovina (BSA) durante toda la noche a 4 °C. La detección se realizó utilizando el kit CytoScan HRP Detection System (Cell Marque) y 3,3-diaminobencidina (DAB, Thermo Fisher Scientific) como cromógeno. Finalmente, los portaobjetos se lavaron con agua destilada, se contracolorearon con hematoxilina y se realizó el montaje.Para todos los receptores observamos inmunomarcación específica citoplasmática, y para el caso particular de MC2R se observó una inmunomarcación específica de la membrana celular, además de la marcación citoplasmática.Estos resultados preliminares son de suma importancia para el desarrollo de nuestro trabajo a futuro, pudiendo plantear el uso de la línea celular BoMac para diversos estudios en la fisiopatología de la reproducción. Puntualmente podremos desarrollar ensayos de co-cultivo de esta línea celular con las BGC-1 y así relacionar esos resultados con los hallados en el modelo in vivo.