ESTUDIO DE LA GLICOSILACIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EN ESCHERICHIA COLI

LANDONI M; CAILLAVA J; CIOCCHINI A; COUTO AS

Cordoba

Simposio; XXIII Simposio Nacional de Química Orgánica; 2021

SAIQO

En los últimos años, la glicoingeniería de bacterias, que combina el conocimiento de laglicobiología de las bacterias con la ingeniería genética, ha surgido como una alternativa viablepara la producción de glicoproteínas que se emplean como antígenos en diagnóstico, vacunasy como agentes terapéuticos. Sin embargo, esta tecnología requiere comprobar la correctaglicosilación de las mismas, para asegurar la obtención del producto deseado.La detección de los anticuerpos generados en respuesta a una infección es unaherramienta útil para el diagnóstico temprano y seroespecífico de pacientes con síndromeurémico hemolítico. Actualmente, la medición de estos anticuerpos, se realiza empleando labacteria completa o el lipopolisacárido (LPS) purificado que puede resultar en falsos positivospor la reactividad cruzada. Las glicoproteínas recombinantes obtenidas mediante estametodología constituirían una nueva generación de antígenos que no generen reactividadcruzada entre diferentes serogrupos y que evitan la mayoría de las desventajas de los métodosquímicos clásicos, reduciendo los costos y mejorando la reproducibilidad de los productos.En este trabajo se realizó el estudio de la glicosilación en glicoproteínas recombinantesde cuatro diferentes serogrupos de Escherichia coli. El objetivo es obtener glicoproteínas quecontengan el oligosacárido correspondiente al antígeno O. Las glicoproteínas fueronproducidas en la E. coli empleando un sistema de N-glicosilación de Campylobacter jejuniaqueconsiste en una oligosacariltransferasa (PglB) que transfiere oligosacáridos sintetizados sobreun lípido (Und-P) a una proteína blanco que tiene la secuencia consenso de N-glicosilación. Lasíntesis del oligosacárido sobre Und-P es equivalente a ladel antígeno O, así, las glicoproteínasson producidas aprovechando toda la maquinaria de glicosilación de la bacteria. Las proteínasse purificaron por cromatografía de afinidad, digeridas con tripsina y los glicopéptidos fueronenriquecidos por micro-HILIC y analizados por nanoHPLC-ESI-Orbitrap. Los resultados fueronprocesados manualmente para determinar las posibles glicosilaciones presentes.En todos los serogrupos estudiados fue posible determinar la presencia del péptido,conteniendo la secuencia consenso, glicosilado con las estructuras correspondientes a losantígenos O esperados. Para el serogrupo O111 se determinó la presencia de la proteína AcrAN-glicosilada con una estructura (didesoxihexosa)2(Hexosa)2(HexosaminaNAc) que coincidecon la estructura descripta previamente para el antígeno O de dicho serogrupo: [α-Colp(1->3)αColp(1->6)]α-D-Galp(1->3)β-D-GlcpNAc.b Para el serogrupo O45, se observó la presencia deun glicano del tipo (hexosa)(desoxihexosa)(desoxihexosaminaNAc) en el sitio previsto de Nglicosilación consistente con la estructura descripta.c El serogrupo O26 mostró una estructura(desoxihexosa)(desoxihexosaminaNAc)(hexosaminaNAc) también en concordancia con ladescripción previa.dFinalmente, el serogrupo O103 presentó una secuencia de tipo(hexosa)(desoxihexosaminaN-hidroxibutiril)(hexosaminaNAc)3 que se corresponde con lacaracterización de bibliografía de su antígeno O.e