GLICOPROTEÓMICA: VENTAJAS Y LIMITACIONES PARA ANÁLISIS DE UN SISTEMA COMPLEJO

CAVALLERO, G; LANDONI, M; COUTO, AS

Mendoza

Simposio; XXII Simposio Nacional de Química Orgánica; 2019

Sociedad Argentina de Investigación en Química Orgánica

La glicoproteómica, fusión de la glicómica y la proteómica, tiene como objetivoidentificar las proteínas que se encuentran glicosiladas, determinar las estructuras de losglicanos que las modifican, los sitios de glicosilación y el nivel de ocupación de estospara un determinado sistema. Esta estrategia provee la completa caracterización de unacélula u organismo en condiciones definidas permitiendo comprender diferentesprocesos biológicos y la potencial funcionalidad de diferentes glicoproteínas. Lainherente complejidad de los hidratos de carbono requiere el uso de diferentes técnicas,y la espectrometría de masa de alta resolución se ha convertido en la más útil.En este contexto nos propusimos analizar, como ejemplo de sistema proteicocomplejo, la clara de huevo de gallina (CEW), para determinar las ventajas y limitacionesde la N-glicoproteómica en comparación con otras técnicas. Así, CEW fue disuelta enagua, las proteínas fueron precipitadas, digeridas con tripsina y luego delenriquecimiento por cromatografía HILIC, los glicopéptidos fueron analizados pornanoHPLC-ESI-orbitrap. Se identificaron 34 proteínas, 19 de las cuales se encontraronglicosiladas. Fue interesante la identificación de glicosilación en seis nuevas proteínas.En cada una de ellas fue posible determinar los péptidos modificados así como laestructura de las glicoformas correspondientes. Siendo la ovotransferrina (OVT) una delas glicoproteínas caracterizadas, se realizó una separación por SDS-PAGE de CEW y labanda con PM correspondiente a la OVT se sometió al mismo análisis. Fue notabledeterminar 80.57% de cobertura de péptidos en la OVT aislada mientras que se obtuvo80.27% para OVT en la mezcla de CEW, lo que mostró la robustez del método. Por otraparte en la OVT aislada se determinó la presencia de dos sitios modificados N637 y N492,el primero con cuatro glicoformas de estructura HexNAc5-7Hex3-4 y el segundo con 25glicoformas del tipo HexNAc2-7Hex3-6. Más aún se determinó por primera vez la presenciade ac. siálico y fucosa en OVT. Cuando se analizó la glicosilación de OVT en la muestracompleja de CEW, solo fue posible identificar el sitio de N-glicosilación N492, con 3glicoformas. Por lo tanto en una mezcla compleja, sólo las glicoformas mayoritariaspueden ser determinadas probablemente debido a la menor eficiencia de ionización delos glicopéptidos frente a péptidos llevando a una baja relación señal/ruido en la mezclacompleja que afecta la selección de iones para la identificación por MS/MS. Un análisisde sitios de glicosilación1 que consiste en marcar la conversión Asn-Asp luego detratamiento con PNGasa F, identificó 14 glicoproteínas, 6 de las cuales fueron comunespor las dos metodologías. Por lo tanto, aunque los glicopéptidos menos abundantespueden no detectarse en el análisis de una mezcla compleja como el CEW, estametodología permite obtener información del sistema en estudio de mayor profundidadque los obtenidos por abordajes estrictamente proteómicos.