“Desarrollo de un control estable para su aplicación en el diagnóstico por RT-PCR de virus con genoma a ARN”

VILLANOVA, GABRIELA VANINA,; GIRI, ADRIANA; GARDIOL, DANIELA

Rosario

Congreso; XXI Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario; 2001

Sociedad de Biología de Rosario

La aplicación de la transcripción reversa (RT) seguida de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para la detección y análisis de agentes virales con genoma a ARN, ha convertido esta metodología en un componente esencial de laboratorios dedicados al diagnóstico clínico y a la investigación virológica. Sin embargo, la labilidad intrínseca del ARN crea la necesidad de un control adecuado que permita verificar la eficacia en la extracción de la muestra y la eficiencia de la reacción. Con el  objetivo de desarrollar una estrategia para la obtención de un control estable para RT-PCR se estudió el genoma del bacteriófago Qß a fin de introducir los cebadores usados en la detección de HCV sin alterar su ciclo replicativo. En la primera fase, y para conocer el funcionamiento del sistema in vitro, el genoma de Qb clonado como cADN en un vector de expresión bajo el control del promotor T7 (pBRT7Qß) fue introducido en la cepa BL21/pLys. Luego de la inducción, se obtuvieron partículas fágicas con  título del orden de 109. Por otro lado, se analizaron las secuencias codificantes y no codificantes del fago en base a las secuencias accesibles en los bancos de datos genómicos. Trabajos reportados anteriormente indican que la región que codifica para las proteínas de la cápside puede ser modificada sin detrimento del ciclo replicativo . En esa región encontramos dos sitios únicos para las enzimas Bst98 I y Nsi I (posiciones 2157 y 2357, respectivamente), que delimitan un fragmento de dimensión similar al amplificado por los cebadores específicos KY78/80 para HCV. pBRT7Qß fue cortado con dichas enzimas, obteniéndose dos fragmentos: 200 pb (Qbp) y 7.300 pb (Qbm), que fueron evidenciados por electroforesis en gel de agarosa al 1% y posterior tinción con bromuro de etidio. Qbm fue purificado del gel y conservado. Paralelamente, se introdujeron los cebadores para HCV por PCR en los extremos del fragmento delimitado por Bst98 I y Nsi I, usando pBRT7Qb como muestra y cebadores de 50 pb de longitud cuyas secuencias incluían KY78 o KY80, secuencias fágicas necesarias para su hibridización y cada uno de los sitios de restricción Bst98 I o Nsi I, respectivamente. Dada la baja homología de estos cebadores se efectuaron 35 ciclos de PCR con un perfil térmico de baja astringencia (20” a 94°C, 20” a 50°C, 20” a 72°C) y con concentración final de MgCl2 variable (1.5-3 mM). Se obtuvieron bandas del peso molecular esperado (Qbp’) en condiciones de Mg+2 = 3 mM. La introducción efectiva de los cebadores de HCV en Qbp’ fue verificada mediante PCR específica con KY78/80 y restricción con Sau3A I que presenta un sitio único interno (posición 2.237). Los resultados obtenidos confirmaron que los cebadores heterólogos fueron introducidos y que las secuencias internas del fago se conservaban entre ellos. Posteriormente Qbp’ fue ligado a Qbm obteniéndose el genoma del fago recombinante como cADN. Se hallan en curso los experimentos de infección con fagos recombinantes que permitirá evaluar la estrategia de clonado y la eficiencia de replicación respecto a la del fago salvaje.