“Desarrollo de un control estable para su aplicación en el diagnóstico por RT-PCR de virus con genoma a ARN”

VILLANOVA, GABRIELA VANINA,; GIRI, ADRIANA; GARDIOL, DANIELA

Florianópolis, Brasil

Congreso; X Jornadas de Jóvenes Investigadores de la A.U.G.M; 2002

Asociación de Universidades del Grupo Montevideo y Universidad Federal de Santa Catarina

La aplicación de la técnica de RT-PCR para la detección de virus con genoma a ARN es muy utilizada en el diagnóstico clínico y la investigación. Debido a la labilidad del ARN es imprescindible un control positivo estable para verificar la eficiencia del procesamiento de las muestras y de la amplificación. Aquí se presenta una estrategia para el desarrollo de un control interno estable que se adicionaría a la muestra para ser procesado y co-amplificado utilizando los mismos cebadores que para el virus diana. Para esto, se propone la utilización de un bacteriófago Qb quimera. Qb es un colifago con genoma a ARN simple hebra del cual se dispone de su genoma clonado como ADNc en un vector de expresión bajo el control del promotor T7 (pBRT7Qb). La partículas fágicas salvajes obtenidas a partir de pBRT7Qb fueron ensayadas en E. coli, con un título constante en el tiempo de 108-109 unidades formadoras de placas por mililitro, demostrando de esta manera que el sistema es regulable, estable y útil para ser utilizado en el diseño del control propuesto. La estrategia plantea la introducción de cebadores heterólogos en el genoma del fago, sin causar detrimento del ciclo replicativo, en la obtención de partículas fágicas recombinantes. Se utilizaron los cebadores KY78 y KY80, ampliamente usados para la detección de virus de hepatitis C (HCV). Al analizar el genoma de Qb se encontró un sitio apropiado para la introducción de dichos cebadores dentro del marco de lectura de la proteína A1 de Qb. En esta región existen sitios de restricción únicos para Bst98 I y Nsi I, limitando un fragmento de 200 pb. Fueron diseñados oligonucleótidos para la introducción de los cebadores KY78 y KY80 en el genoma del fago mediante técnica de PCR. La introducción efectiva fue verificada y el amplicón resultante fue clonado en el pBRT7Qb, sustituyendo en Qb el fragmento salvaje correspondiente por un fragmento de igual tamaño flanqueado por KY78 y KY80. Se encuentran en curso los experimentos de infección con fagos recombinantes para evaluar la eficiencia de replicación y el funcionamiento del sistema. Esta estrategia proporcionaría una herramienta de gran utilidad para la obtención de controles estables para el diagnóstico molecular de virus con genoma a ARN.