CONICET | Buscador de Institutos y Recursos Humanos

Introducción: La intensa actividad agropecuaria ha incrementado la presencia de residuos de agroquímicos, especialmente el controvertido herbicida glifosato y los pesticidas organofosforados y carbamatos. Si bien tal herbicida es considerado por la OMS levemente tóxico, es ampliamente conocida la toxicidad que presentan estas familias. Los métodos analíticos que emplean enzimas pueden ser considerados herramientas competitivas para el monitoreo ambiental por sus respuestas en tiempo real y sus bajos costos. La metaloenzima fosfatasa alcalina, ALP, relativamente económica y estable, es capaz de hidrolizar a esteres monofosfatos; y su actividad podría ser alterada por compuestos tóxicos[1]. Con el objetivo de contribuir al desarrollo de métodos rápidos para la detección de tales agroquímicos; en primer lugar se optimizó económicamente el desarrollo de electrodos de uso electroquímico, teniendo como premisa que los materiales para su construcción sean de fácil adquisición en nuestro país. En segundo lugar, se evaluó el rendimiento electroquímico de los mismos para la determinación de la actividad de la ALP mediante un bioensayo y un biosensor utilizando como técnica de detección la voltametría de onda cuadrada (VOC). En última instancia, se evaluaron y optimizaron sus respuestas frente al carbaril, clorpirifos, metil-azinfos y glifosato; para desarrollar y validar dos métodos de cribado para estos agroquímicos utilizando un bioensayo y un biosensor. Resultados: a) Elaboración y caracterización electroquímica de electrodos a base de grafito. Se diseñaron y se emplearon para la construcción del transductor electroquímico materiales tales como PVC de alta densidad y acrílico; y para la optimización del conductor interno se empleo un tubo y un clavo de cobre. Los composites fueron elaborados con distintas pasta poliméricas y con polvo de grafito como material conductor. En la caracterización se utilizó una solución de ferricianuro 2 mmol L-1 en 100 mmol L-1 NaCl; analizando parámetros tales como reversibilidad del sistema, sensibilidad de la respuesta, área efectiva y repetibilidad. b) Diseño y optimización del bioensayo electroquímico. Para el diseño del bioensayo se optimizaron parámetros experimentales tales como: tiempo de respuesta, naturaleza del buffer, concentración de ALP y concentración de sustrato. Las condiciones óptimas seleccionadas fueron 150 s, buffer carbonato de sodio 0.1 mol L-1 y KCl 0.1 mol L-1 de pH = 9.0, 0.25 UI mL-1 y 0.25 mmol L-1, respectivamente. Posteriormente se evaluó la variabilidad del sistema determinando la repetibilidad sin y con regeneración de la superficie por pulido mecánico y electroquímico, y la precisión intermedia. Pudiendose determinar la necesidad de regeneración mecánica y un funcionamiento operacional de 800 determinaciones. c) Diseño y optimización de un biosensor electroquímico. La ALP fue inmovilizada utilizando a la albúmina bovina sérica (BSA) como proteína inerte, al glutaraldehído como agente entrecruzante y al nafion como formador de un film polimérico. Los contenidos de la enzima y demás componentes fueron optimizados mediante un diseño central compuesto. El protocolo de inmovilización optimizado consistió en la deposición sobre la superficie electródica de 40 L de una solución de ALP (1.33 UI) y BSA (0.16 % p/v), posteriormente se dejó secar a temperatura ambiente por 2 horas y luego se cubrió la superficie con 35 L de una solución de nafion (0.14 % p/v). Después de analizar el modelo obtenido por el diseño, se concluyo que la no presencia de glutaraldehído favorecía la respuesta. Esto resultaría coherente ya que frente al bajo contenido proteíco involucrado en la inmovilización, solo bastaría el film de nafión para la retención de la enzima sobre la superficie electródica. d) Aplicación del bioensayo y del biosensor para la detección de pesticidas. El tiempo de incubación entre la enzima y los agroquímicos previos a la determinación electroquímica, fue de 30 y 10 minutos, para el bioensayo y para el biosensor, respectivamente. Luego, se construyeron curvas de inhibición: % de actividad remanente de ALP versus la concentración de los pesticidas. Se calculo , donde S0 y S1 correspondían a la respuesta en ausencia y en presencia de agroquímicos respectivamente. Se consideró una respuesta positiva, que evidenciaba la presencia de un agroquímico, a todo % que se diferenciara del valor (S0 ± 15) %. 100 ) ( % 0 1       S S AREM e) Validación de los métodos de cribado basados en el bioensayo y del biosensor. Se determinaron los parámetros de calidad sugeridos por la AOAC y la ICH tales como Límite de Detección (LOD), Límite de Corte, proporción de Falsos negativos (error tipo II), proporción de Falsos positivos (error tipo I), Sensibilidad y Especificidad; para la definición de los mismos se utilizó el test de hipótesis. Mediante el bioensayo se lograron valores de corte para el carbaril, el metil-azifos, el clorpirifos y el glifosato, de 52, 35, 4 y 102 mg L-1 respectivamente y en todos los casos la proporción de Falsos negativos fue menor al 10%. Los valores de corte obtenidos a partir del biosensor no fueron diferentes estadísticamente a un nivel de confianza del 95%, no obstante la porporción de los falsos negativos tomó valores superiores (entre 15 18 %). Conclusión: Se fabricaron transductores a base de grafito robusto, económico y con propiedades electroquímicas apropiadas para su posterior aplicación en el desarrollo de dos métodos de cribado para la detección de agroquímicos, uno basado en un bioensayo y otro en un biosensor, con tiempos de ensayo de 45 y de 15 minutos respectivamente. Los valores de corte obtenidos fueron elevados lo que determina que dichos métodos no serían adecuados para el control de agua de consumo humano, pero si podrían ser útiles para el monitoreo in situ de lugares de alto impacto ambiental. La perspectiva del trabajo se direccionará en la busqueda de la disminución tanto de los valores de corte como de las dimensiones del transductor electroquímico.

enviar mensaje