Uso de nanoparticulas de oro como sondas para la localización de proteínas en espermatozoides por microscopia electrónica

M. VICTORIA BERBERIAN; CRISTIAN A. POCOGNONI; LUIS S. MAYORGA

San Carlos de Bariloche

Congreso; 4to Congreso Argentino de Microscopia SAMIC 2016.; 2016

Instituto Balseiro-SAMIC

USO DE NANOPARTÍCULAS DE OROCOMO SONDAS PARA LA LOCALIZACION DE PROTEINAS EN ESPERMATOZOIDES PORMICROSCOPIA ELECTRONICA Berberián, M.V. [1,2],Pocognoni C.A. [2] y Mayorga L.S. [2] Facultadde Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad Nacional de Cuyo (FCEN-UNCuyo)[1] e Instituto de Histología y Embriología Mendoza (IHEM-CONICET/UNCuyo)[2],Mendoza, ArgentinaEmail: victoria.berberian@gmail.com  Lalocalización celular de proteínas suele determinarse mediante ensayos deinmunofluorescencia indirecta (IFI) utilizando anticuerpos. Lamentablemente,IFI tiene limitaciones técnicas que impiden establecer la ubicación exacta de proteínas enestructuras intracelulares próximas ente sí, tales como las que se observan enla cabeza del espermatozoide humano. En este caso, IFI no permite determinar siuna proteína está asociada a la membrana acrosomal externa, a la membranaplasmática del espermatozoide, o a ambas[1].Recientemente nuestro grupo de trabajo ha comenzado a desarrollar unaestrategia alternativa para localizar proteínas en espermatozoides. La técnicainvolucra el marcado de proteínas recombinantescon nanopartículas (NPs) de oro, desnudas (i) o acopladas a ácido nitrilotriacético yníquel (ii, Ni-NTA-Nanogold). Las NPs, con diámetros de 5 a 20 nm, sondetectadas posteriormente por microscopía electrónica de transmisión (TEM). Encomparación con IFI, el marcaje de proteínas conNPs de oro permite alcanzar una resolución espacial precisa, ya que las NPsutilizadas son mucho más pequeñas que un anticuerpo y cuando se unen a unaproteína lo hacen a una distancia corta, del orden de los 1,5 nm. La nueva técnica ofrece ademásuna alternativa simple a la compleja técnica de inmunomarcado con oro coloidal,que se utiliza tradicionalmente para localizar proteínas por TEM.En el presente trabajo reportamosresultados obtenidos bajo las siguientes condiciones: i) Uso de NPs de oro desnudas para marcar proteínasrecombinantes. En este caso NPs de oro de 20 nm de diámetro fueron incubadas con laproteína permeablemetalotioneina (CPP-MT). Esta proteína es rica en cisteínas y se une a lasNPs mediante enlaces de tipo tiol. La CPP-MT marcada fue puesta en contacto conespermatozoides humanos a 37 oC durante 3h. La interacción delcomplejo CPP-MT-NP con las células se monitoreó por TEM, así como también porIFI y por ensayos funcionales. En la figura 1 se presentan dos micrografías TEM quemuestran la localización de las NPs en las células. Como puede observarse CPP-MTse ubica en la cola y pieza media del espermatozoide, y en menor medida en elacrosoma y en el núcleo celular. ii) Empleo de NPs de oro de 5nmde diámetro acopladas a Ni-NTA para ubicar proteínas recombinantes. Estas NPs contienen iones níquely muestran gran afinidad por proteínas que posean un tag de His-6. La proteína recombinante VPS4BE235Q?His6fue inicialmente incubada con espermatozoides humanos a 37ºC, permeabilizadoscon SLO y estimulados con 10 µM de calcio por 30 min. Posteriormente las célulasfueron incubadas en presencia de las NPs y observadas por TEM. En la figura 2 semuestra una micrografía TEM en la que es evidente la localización de las NPs sobrelas distintas membranas del espermatozoide. La técnica propuesta resultó  satisfactoria y es claramente visible que laproteína VPS4BE235Q ?His6 se localiza en el citosol y en lasregiones con invaginaciones de la membrana acrosomal. También se destaca laausencia de proteína en el núcleo celular.