Purificación y caracterización espectroscópica de BLUF46, uno de los fotorreceptores putativos tipo BLUF del patógeno humano Acinetobacter nosocomialis.

ALBA LOTO; PAULA C. JAIME; ABATEDAGA, INES; MARIA ALEJANDRA MUSSI; BORSARELLI, CLAUDIO D.; LORENA VALLE

Bariloche

Congreso; IV Reunión de Fotobiólogos Moleculares Argentinos; 2018

Los dominios BLUF (Blue Light sensing Using FAD) son fotorreceptores cuyo cromóforo esFAD. Pueden intercambiar de forma reversible desde un estado oscuro, dBLUF, a un estadoseñalizador, sBLUF, por excitación con luz azul [1, 2]. Estos dominios son ampliamenteestudiados ya que proporcionan una extensa fuente de plantillas moleculares para laingeniería de proteínas fluorescentes, biosensores y herramientas optogenéticas [3].Acinetobacter nosocomialis es un patógeno oportunista, que presenta en su genoma 3regiones que codifican para dominios putativos BLUF [4], a los cuales denominamos BLUF46,BLUF65 y BLUF85.En este trabajo se expresó de manera heteróloga uno de los fotorreceptores putativospresentes, BLUF46. El mismo se purificó con dos variantes de cromatografía de afinidad pormetales inmovilizados (IMAC) y de exclusión en gel.Las espectroscopías de régimen estacionario (absorción y emisión UV-Vis) revelaron que laproteína obtenida, responde ante estímulos de luz azul, y que presenta característicassimilares a las pertenecientes a la familia BLUF.Se demostró que, entre el rango entre 13°C y 32°C, BLUF46 muestra el fotociclocaracterístico, con un progresivo deterioro en la eficiencia del proceso para temperaturasmayores a 28°C. Asimismo, los resultados de fluorescencia dinámica, TCSPC, sugieren queposterior a los 24°C, la temperatura impacta sobre la interacción cromóforo-entorno, enespecial el residuo de Tyr8, modificando las condiciones estructurales necesarias para lafotoactivación.Se determinó la energía de activación para la formación de ambos estados de la proteína,siendo el proceso activado por luz prácticamente independiente de la temperatura, pero noasí la relajación en oscuridad que se activa con aproximadamente 50 kJ/mol. Finalmente,BLUF 46 mostró capacidad de recuperar su funcionalidad fotoinducida posterior alcalentamiento, a lo que denominamos reversibilidad, hasta T ≤ 32°C. Estos resultados indicanel delicado balance estructura-actividad con la temperatura para este tipo de BLUFs.