Clonado, expresión y caracterización de nuevos dominios LysM para el desarrollo de una plataforma con múltiples aplicaciones biotecnológicas.

RAYA TONETTI, FERNANDA; PADILLA FRANZOTTI, C.; SACUR, JACINTO; VILLENA, J.; VIZOSO PINTO, M. G.

Tucuman

Simposio; SAPROBIO 2018; 2018

ResumenIntroducciónEl motivo de lisina(LysM), ampliamente conservado en eucariotas y procariotas, se une específicamente al peptidoglicano. En Lactobacillus fermentum identificamos proteínas con estos dominios y seleccionamos una con un único dominio LysM y otra con cinco con el objetivo de caracterizarlos respecto a su unión al peptidoglicano, identificar el de mayor capacidad de unión y construir un vector de destino (Gateway) que permita etiquetar proteínas con el dominio elegido.MetodologíaDos dominios LysM y LysM5 amplificados a partir del genoma de L. fermentum por PCR, fueron clonados por recombinación (reacción BP, Gateway) en pENTR207. Luego, por una reacción de recombinación (LR) con los sitios attR se los insertó en el vector destino pETGA-N-His-Venus[rfB]. En E. coli Rosetta transformada con estos plásmidos, se indujo la expresión de proteínas con IPTG. Se evaluó la capacidad de unión de las proteínas quimeras recombinantes a bacterias vivas y tratadas con ácido/calor por microscopia de fluorescencia y citometría de flujo. Se construyó un nuevo vector de destino (Gateway) mediante un cassette personalizado 5?-HindIII-ATG-[RGS-His-tag-LysM5]-EcoRV-[ccdB/CmR(rfB)]-EcoRV-XbaI-3? en el vector vector pET-22b(+). Resultados y DiscusiónLysM5 se une a la pared celular de bacterias tratadas con ácido/calor más uniformemente que LysM, como se observó por microscopia de fluorescencia con Venus como proteína reportera. Se seleccionó LysM5 para construir un plásmido de expresión bacteriana que permita etiquetar cualquier proteína de interés. Así logramos presentar una proteína obtenida en condiciones nativas y/o desnaturalizantes sobre la superficie de bacterias como demostramos con Venus. ConclusionesEl tratamiento de bacterias con ácido/calor aumenta la exposición de peptidoglicano y permite la unión de Venus fusionada a LysM5 a toda la pared celular. Presentamos una plataforma de múltiples aplicaciones biotecnológicas como: la presentación heteróloga de antígenos sobre bacterias como vectores de vacunas, la purificación de proteínas etiquetadas e inmovilización de enzimas con fines industriales.