Desarrollo y validación de un enzima inmunoensayo para el serodiagnóstico de hepatitis E - Seroprevalencia en Tucumán.

ARCE, L.; OLEA, C.; MARRANZINO, G.; AGOTE, F.; VIZOSO PINTO, M. G.

Valle Hermoso, Cordoba

Jornada; XXXVIII Reunión Científica Anual de la SAV; 2018

AAM

El virus de la hepatitis E (VHE) causa infecciones que suelen ser autolimitadas pero a veces son fulminantes. En mujeres embarazadas el riesgo de sufrir hepatitis fulminante es mayor (aprox.25%). Recientemente, también se describieron casos de hepatitis crónicas en pacientes inmunocomprometidos. De los 4 genotipos (GT) existentes, en Argentina circula el GT3. El diagnóstico se basa principalmente en la detección de anticuerpos específicos. En nuestro país se utiliza un único kit importado (DIAPRO). Objetivo: clonar, expresar, purificar la proteína ORF2 de VHE GT3, desarrollar un enzima inmunoensayo (ELISA) para detectar anticuerpos anti-VHE en suero. Evaluar la sensibilidad y especificidad del nuevo ensayo y estimar la seroprevalencia en donantes de sangre de Tucumán. Métodos: ORF2 es un polipéptido recombinante de 66 kDa correspondiente a los aminoácidos 112-608 de la proteína de la cápside del VHE. Esta secuencia se subclonó en pETG-N-RGS-His-[rfB] mediante clonado recombinatorio Gateway® y se transformó en E. coli Rossetta. Se optimizó la expresión de la proteína. Se la purificó en condiciones nativas y desnaturalizantes usando cromatografía de afinidad (NiNTA). ORF2 purificada se examinó mediante SDS-PAGE al 10% y western blot y se cuantificó por Bradford (Bio-Rad). Para desarrollar el ELISA, se probaron diferentes concentraciones de proteínas (0,1-10 μg/ml), agentes bloqueantes, diluciones de suero, anticuerpo secundario y sustrato. Para la validación del ELISA (cut-off, sensibilidad, especificidad, capacidad y límite de detección) se emplearon 46 sueros negativos y 26 positivos (caracterizados con el kit de DIAPRO). Para el estudio de seroprevalencia se analizaron 813 sueros de donantes de sangre. Resultados: ORF2 GT3 VHE se expresó óptimamente a 37°C con IPTG 1 mM durante 3 h. Se puso a punto el ELISA basado en ORF2 GT3 nativa para detectar anticuerpos anti-VHE de tipo IgG. Mediante análisis ROC (Característica Operativa del Receptor) encontramos una sensibilidad de 100 %, especificidad 97,8 % para un valor de cut off de 0,499 y buena capacidad discriminativa debido a su AUC (área debajo de la curva) de 0,998, sin embargo su límite de detección fue ligeramente menor que el kit comercial DIAPRO basado en péptidos sintéticos. Con el nuevo ELISA in house pudimos determinar que en donantes de sangre de Tucumán, la seroprevalencia es de 8,3 %. Conclusión: desarrollamos un ELISA para detectar anticuerpos anti-VHE utilizando como antígeno la proteína recombinante ORF2 VHE GT3 con una especificidad de 97,8 % y sensibilidad de 100 %. El kit desarrollado en nuestro laboratorio permite hacer ensayos a menor costo que el kit importado. La seroprevalencia encontrada en Tucumán es un llamado de alerta para la vigilancia epidemiológica de este patógeno emergente. Además, indica la necesidad de incluir el diagnóstico de Hepatitis E en los protocolos de rutina para diagnosticar hepatitis infecciosas.