Diseño, expresión y presentación de antígenos recombinantes del virus de la hepatitis E sobre la superficie de partículas semejantes a bacterias para el desarrollo de una vacuna de subunidad

MÜLLER, M.; RAYA TONETTI, FERNANDA; ARCE, L.; PADILLA FRANZOTTI, C.; VILLENA, J.; VIZOSO PINTO, M. G.

Vaquerías, Cordoba

Jornada; XXXVIII Reunión Científica Anual de la SAV; 2018

AAM - SAV

La hepatitis E es una enfermedad aguda que se transmite por vía fecal-oral y generalmente es autolimitante pero en embarazadas está asociada a una elevada mortalidad (~20-30%). Su agente etiológico es un virus ARN monocatenario positivo (+ssRNA) no envuelto cuyo genoma es de aprox. 7,2 kb y pertenece a la familia Hepeviridae. La respuesta inmune contra el virus de la Hepatitis E se dirige principalmente contra la proteína de la cápside viral ORF2. El motivo lisina (LysM) es un motivo ubicuo en bacterias responsable de la unión de enzimas se unan no covalentemente al peptidoglicano de la pared celular. Esta propiedad puede explotarse para diseñar vacunas que consisten en proteínas recombinantes fusionadas al dominio LysM y ancladas a la superficie de partículas similares a bacterias (BLP). Las partículas semejantes a bacterias (BLP) son micropartículas que se obtienen por tratamiento ácido/térmico de lactobacilos inmunomoduladores. Este tratamiento produce la muerte celular y expone el peptidoglicano de su pared aumentando la capacidad de unión a los motivos LysM sin afectar sus propiedades adyuvantes. Objetivos: clonar ORF2 como una proteína de fusión con dominio LysM, generar BLP a partir de L. rhamnosus para utilizarlas como plataforma para exponer el antígeno de cápside de HEV. Métodos: se realizó una PCR anidada para amplificar el gen ORF2 y para introducir simultáneamente las secuencias attB en sus extremos. La BP Clonasa (Gateway) catalizó la recombinación de este producto de PCR con un plásmido con sitios attP para generar clones de ?Entrada?. El siguiente paso consistió en una recombinación catalizada por LR clonasa que reconoce los sitios attL de este plásmido y los sitios attR del vector Destino (pENHAc-[rfB]) para entonces generar el plásmido de expresión pENHAc-ORF2 y transformar en E. coli Rosetta por shock térmico. las BLP se obtuvieron de cultivos en MRS de 16 h de L. rhamnosus, concentrados y tratados con 0.1 M HCl durante 30 minutos en baño de agua hirviendo. Luego se lavó con PBS estéril y se concentró a 2,5 x 1010 BLP / ml. Para la unión de la proteína a la superficie de las BLP, el extracto crudo de la expresión se incubó con las BLP con rotación orbital durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego se lavó con PBS estéril. Se evaluó la unión de las proteínas a las BLP mediante SDS-PAGE. Resultados: la expresión de ORF2-LysM se logró con una inducción de 3 hs a 37° C con IPTG 0.5 mM. Fue posible purificar la proteína de cápside mediante la unión específica del dominio LysM al peptidoglicano expuesto en la superficie de las BLP. La proteína recombinante se une a las BLP como se demostró por SDS PAGE. Conclusión: Fue posible purificar la proteína ORF2-LysM utilizando BLP como matriz de afinidad. El antígeno expuesto sobre la superficie de BLP derivadas de bacterias inmunomoduladoras se utilizará para inmunizar ratones por vía oral para evaluar la capacidad de este complejo de generar inmunidad específica.