Estudios clásicos y ómicos para la caracterización del estrés ácido en rizobios noduladores de alfalfa

DRAGHI, W.O.; DEL PAPA, M.F.; PISTORIO, M.; LOZANO, M.J.; GIUSTI, M.A.; TORRES TEJERIZO, G.A.; HELLWEG CH.; WEIDNER, S.; NIEHAUS, N.; PÜHLER A.; LAGARES, A.

Cordoba, Argentina

Congreso; XXIII Reunión Latinoamericana de Rhizobiología; 2007

Asociación Latinoamericana de Rhizobiología

La acidez de los suelos es un factor de estn§s importante en suelos de cultivo de diferentes fuga res del mundo (von Uexull y Mutert, 1995) restringiendo de modo severo la sobrevivencia de rizobios y su inter¬accion simbiotica con leguminosas (Glenn y Dilworth, 1994). En razon de la complejidad de los diferentes estreses abioticos en general, y del estres acido en particular, la aproximacion experimental al problema del crecimiento y la simbiosis ha sido abordada desde diferentes perspectivas cornplementarias, incluyen¬do- la caracterizacion de los organismos participantes (especies, diversidad), su aptitud diferencial para hacer frente a la condicion de estres, los fenotipos simbioticos en condiciones controladas (capacidad de infeccion y fijacion de nitrogeno), el desempeno simbiotico cuando el estres acido opera, y finalmente la evaluacion prospectiva de capacidad de los participantes para establecerse y propagarse a rnediano y largo plazo en los suelos de cultivo sometidos a la condicion de estres.En Argentina, donde existe una amplia region (centro del pais) dedicacla al cultivo de alfalfa, es un hecho reconocido la paulatina y sostenida acidificacion de una irnportante proporcion de dichos suelos, alcanzando en algunos lugares valores de pH condicionantes de la simbiosis de rizobios con alfalfa particularmen¬fe sensible a los iones hidrogeno. A raiz de estas observaciones, y dado que la acidez es un factor de estres simbiotico extendido a lo largo del globo, en nuestro laboratorio comenzamos hace 10 años a caracterizar de modo intensivo el tipo de rizobios noduladores de alfalfa presentes en suelos de Argentina y Uruguay, comparado los mismos con aislamientos de otros suelos acidos, y caracterizando determinantes geneticos de cada grupo asociados a sus caracteristicas simbioticas y de acido tolerancia.Del Papa et al. (1999) han identificado en suelos de Argentina y Uruguay la presencia de dos tipos diferentes de rizobios con capacidad de nodular alfalfa. Un grupo mayoritario representado par Sinorhizobium meliloti, el simbionte fijador de nitrogeno; y otro grupo representado por rizobios relacionados con la cepa Or-191, promiscuos, acido tolerantes, ineficientes, y altamente competitivos para la nodulacion de alfalfa en condiciones acidas (Del Papa et al., 1999; Segundo et aI., 1999; Wegener et al., 2001). Esta serie de caracteristicas plantearon la necesidad de caracterizar de modo mas detallado tanto la ecologia como las caracteristicas simbioticas y moleculares de la acido tolerancia de estos rizobios, hacia una evaluacion que permita determinarla evolucion mas probable de este grupo de rizobios en los suelos locales, asi como su eventual impacto sobre la poblacion fijadora de S. meliloti. Conocida la marcada tolerancia a la acidez de las cepas tipo Or-191 y su destacada competitividad para nodular en dicha condicion, analizamos en ensayos de microcosmos la capacidad de las cepas de tipo Or-191 de persistir en muestras de suelo acido irradiado y del mismo suelo neutralizado, tanto en ausencia como en presencia de la planta huesped (Del Papa et aI., 2003). Los resultados mostraron que en las muestras de suelo acido sin plantas el número de rizobios acido tolerantes supera el que alcanza S. meliloti. En presencia de plantas de alfalfa, sin embargo, S. meliloti mostro un mejor establecimiento en los microcosmos acidos respecto de las cepas tipo Or-191. Tal evidencia sugiere un aprovechamiento diferencial positivo del recurso rizosferico por parte de S. meliloti respecto de los rizobios de tipo Or-191 a pesar de la acido tolerancia de estos últimos. Si bien existe profusa informacion en la literatura respecto de la influencia positiva del entorno rizosferico para rizobios, y microorganismos en general, las evidencias obtenidas muestran que las raices de alfalfa ejercen una promocion diferencial del crecimiento de S. meliloti respecto de las cepas tipo Or-191, hecho este que refleja de modo muy temprano las diferencias que se observan mas tardíamente en la asociacion de la planta con cada uno de estos rizobios (la diferenciación en bacteroides y fijación de nitrógeno de estos rizobios es muy pobre). Será interesante evaluar entonces si las raices de otras plantas manifiestan o no la misma promocion diferencial del crecimiento de S. meliloti respecto de los rizobios acido tolerantes, con el proposito de establecer si se trata de una cualidad especifica de alfalfa hacia su simbionte fijador. Los efectos positivos tempranos de alfalfa sobre S. meliloti que hemos obtenido en los experimentos con microcosmos (que no operan del mismo modo sobre las cepas tipo Or-191) son consistentes can las observaciones de Barber en campos de Oregon (1984) donde la ausencia de la planta favorecia el establecimiento de poblaciones acido tolerantes e ineficientes. La presencia continua de alfalfa se muestra como un factor biótico importante (en laboratorio y a campo) para favorecer el establecimiento de S. meliloti por sobre el de las cepas de tipo Or191. Lamentablemente, no es sencillo alcanzar un recuento de rizobios noduladores de alfalfa que refleje de modo confiable la proporcion de rizobios tipo Or-191 cuando los mismos estan presentes en suelos de cultivo. Dos caracteristicas esenciales dificultan el recuento de dichos rizo¬bios. En primer lugar la topologia de las infecciones radiculares (raices laterales, eventos mas tardios) que redunda en la subestimacion de rizobios de tipo Or-191 por tecnicas convencionales de MPN (numero mas probable). En segundo lugar, la muy poco caracterizada distribucion de estas cepas a lo largo de los horizontes del suelo comparado con S. meliloti. Un estudio realizado por nuestro laboratorio en colaboración con el lNTA Castelar ha mostrado que mientras en el horizonte superficial existe predominio de S. meliloti, entre los 30-120 cm el 90 % de los aislamientos resultaron de tipo Or-191. Los comentarios precedentes muestran claramente la necesidad de contar con un metodo adecuado de deteccion y recuento de rizobios tipo Or-191, que permita relevar la presencia de estas cepas a campo, y caracterizar de modo mas acabado su distribucion y dinamica en los diferentes horizontes respecto de S. meliloti. Si bien contamos con un ensayo de PCR especffico que hemos desarrollado para las cepas tipo Or-191, la sensibilidad que hemos alcanzado (104 genomas/reaccion de PCR) no permite hasta el momenta implementarlo al analisis de muestras de DNA extraídas de suelos.EI interes de nuestro grupo en la caracterizacion de los rizobios tipo Or191 se relaciona con varias caracteristicas peculiares de este tipo de bacterias. Desde el punto de vista simbiotico, como hemos descrito precedentemente, requieren atencion por su presencia en suelos de cultivo locales y de otras regiones del mundo, por su ineficiencia para fijar nitrogeno, su marcada acido tolerancia, y su elevada competitividad en acidez frente a S. meliloti. La segunda cuestion de interes esta Iigada a que mientras el analisis de rDNA 16S de estos rizobios los posiciona filogeneticamente como organismos relacionados en su cromosoma (de modo distante) con los actuales rizobios noduladores de poroto, arveja y trebol, el analisis de genes simbióticos como nifH y nodC los acerca a S. meliloti (Laguerre et al. 2001). Estas evidencias resultan particularmente interesantes desde el punta de vista evolutivo considerando la capacidad de estos rizobios de nodular (al menos) poroto, alfalfa, y Leucaena leucocephala. En este marco, la marcada especificidad de alfalfa para con S. meliloti y la estricta necesidad de sulfatacion de los factores de nodulacion en el carbono C6 del extremo reductor, plantean la necesidad de verificar si existe sulfatacion de las señales producidas por estos rizobios, o si existen moleculas quimicamente diferentes que habilitan la simbiosis con alfalfa. En nuestro laboratorio hemos puesto en evidencia recientementela presencia en copia unica de un ortologo del gen nodH que codifica para la C6 sulfotransferasa de los factores de nodulacion. Hemos demostrado ademas que dicha enzima es capaz de complementar mutantes nodH de S. meliloti restaurando la simbiosis en alfalfa y la sulfatacion de la molecula señal. Resulto particularmente interesante, que tanto la secuencia de nodH como la sintenia de los genes inmediatos se corresponden con la secuencia y organizacion existente en S. meliloti, hecho este que presenta a las cepas tipo Or-191 como una quimera resultante posiblemente de la combinacion de un cromosoma proveniente de un ancestro aun no bien caracterizado geneticamente vinculado a los actuales noduladores de poroto/arveja/trebol, con genes megaplasmidicos adquiridos horizontalmente desde un sinorizobio dador. Las diferentes caracteristicas fenotipicas y genotipicas de los rizobios tipo Or-191 plantean las siguientes cuestiones aun abiertas: a) ¿existe alguna leguminosa en la que estos rizobios alcancen una simbiosis efectiva?, b) ¿Ios rizobios tipo Or-191 representan organismos ineficientes en transito hacia una eventual simbiosis efectiva? y c) ¿son una reminiscencia parasitica actual de un ancestro fijador? Sea cual fuera el caso, su peculiar estructura genomica los posiciona como organismos utiles para avanzar en el conocimiento y caracterizacion de Ias estrategias evolutivas utilizadas por los rizobios en su evolucion (mantenimiento) hacia el(del) estado simbiotico. Sera clave evaluar de modo mas extenso el rango de especies leguminosas con capacidad de asociarse con los rizobios tipo Or-191, asi como avanzar en la caracterizacion genomica mas exhaustiva de los diferentes replicones.Aproximaciones omicas a la caracterizacion del comportamiento de rizobios en el entorno acidoUno de los enfoques mas utilizados en la ultima decada para la identificacion de componentes de los rizobios asociados a la respuesta al estres acido (en particular determinantes de tolerancia a la acidez) ha sido la mutagenesis y busqueda de clones que resulten acido sensibles (Glenn et al., 1999). De este modo se han podido identificar varios genes (act, acid tolerance) en S. medicae que que son importantes para la expresión del nivel salvaje de acido tolerancia. No se conoce para ninguno de los genes act, sin embargo, la funcion bioquimica precisa a traves de la cual el producto de traduccion ele los mismos mejora el crecimiento bacteriano bajo estres acido. Puede afirmarse por otra parte que el perfil de tolerancia de la cepa salvaje es la resultante de la contribucion de un numero importante de productos genicos donde ninguno per se modifica de modo drastico el fenotipo de tolerancia acida. Por otra parte, no existen actualmente evidencias que indiquen la presencia de variantes alelicas de los genes act que confieran fenotipos de mayor resistencia. Tal situacion brinda al momenta (y posiblemente en el futuro mediato) pocas alternativas practicas para la manipulacion genetica racional de la tolerancia acida con fines practicos. Por esta razon, la caracterizacion omica de la bioquimica del estres acido en S. medicae (Reeve et aI., 2004) y S. meliloti (nuestro laboratorio) ha sido considerada como una alternativa valiosa para obtener una vision mas general de los cambios de expresion inducidos por la acidez. En nuestro laboratorio hemos analizaelo los proteomas diferenciales de rizobios crecidos en medio minimo a pH 7,0 y 6,1 en cultivos continuos crecidos en quimiostato. EI analisis de los proteomas en geles bidimensionales permitio reconocer varios marcadores de expresion diferencial entre ambas condiciones, la mayoria de los cuales pudieron ser identificados por huella peptidica-espectrometria de masa UV-MALDI-TOF. Con el proposito de caracterizar los genes que modifican su expresion en medio acido, y comparar los resultados con los obtenidos a partir de la caracterizacion proteomica, analizamos et transcriptoma de la condicion acida y neutra utilizando microarreglos en vidrio. Dicho analisis mostro una muy alta correspondencia con los marcadores de expresion diferencial obtenidos desde la evaluacion proteomica. La comparacion de ambos proteomas y el analisis de los transcriptomas puso de manifiesto que: a) mientras las celulas que crecen a pH 7,0 cubren un grupo diverso de funciones metabolicas, las celulas creciendo a pH acido concentran sus actividades en la maquinaria de traduccion, la preservacion y biosintesis de la envoltura celular, y la produccion de energia; b) mientras el metabolismo de aminoacidos parece ser intenso en la condicion neutra, las especies vinculadas al metabolismo de carbohidratos son caracteristicas del crecimiento bajo estres acido (debido muy probablemente a dificultades en la generacion de energia); c) debido a que hemos analizado en esta primera instancia el proteoma citoplasmico, las proteinas asociadas a la movilidad, metabolismo lipidico, y componentes respiratorios (en su mayoria de membrana) estuvieron sub-representados; d) no se han detectadofactores de transcripcion en el conjunto de proteinas identificadas en arnbos proteomas (debido probablemente a puntos isoelectricos sesgados al extremo basico, y/o a su baja concentracion intracelular). Utilizando la coleccion de S. meliloti generada por STM (signature tagged mutagenesis) (Pobigaylo et al., 2006) ya disponemos de varios mutantes alterados en los marcadores diferenciales identificados, y hemos comenzado a evaluar posibles consecuencias funcionales para el crecimiento (tolerancia a la acidez, induccion de la respuesta inducida de adaptacion a la acidez-ATR) y para la simbiosis a bajo pH. Con la aproximacion omica hemos obtenido una imagen mas clara de las principales funciones en las que el rizobio concentra su actividad ante el desafio del entorno acido. Estamos evaluando actualmente si alguno (o varios) de los marcadores diferenciales identificados tiene(n) relevancia funcional para la toterancia al estrés acido y/o para la actividad simbiotica en esa condicion. La disponbilidad de dicha informacion esperamos nos acerque con mejores herramientas a la altemativa aun dificil de manipuar de modo positivo la sobrevivencia y crecimiento en acidez de S.meliloti.