Generación de antígenos recombinantes para la implementación de ensayos de diagnóstico serológico de Flavivirus de importancia regional

LORCH MS; COLLADO MS ; ROTA PR; ARGUELLES M H

Buenos Aires

Congreso; XII Congreso Argentino de Virología, V Simposio de Virología Clínica, III Simposio de Virología Veterinaria; 2017

Asociación Argentina de Microbiología

>El diagnóstico para Flavivirus está fuertemente centrado en el empleode ensayos serológicos, ya sea de forma directa (determinación de antígenostempranos), o indirecta (determinación IgM o IgG en suero o LCR de pacientes).Sin embargo, las técnicas de Rapid Diagnostic Tests (RDTs) no suelen contemplarel complejo escenario de Flavivirus presente en la región, perdiendoespecificidad, con lo que se debe recurrir a técnicas más complejas como la neutralización. Esta situación plantea la necesidad de desarrollar métodos dediagnóstico sencillos que permitan diferenciar una infección producida porestos agentes virales, en cuyo diseño se contemplen los diversos agentes que seencuentran circulando. El objetivo de este trabajo se centra en la expresión dela proteína recombinante NS1 de flavivirus en su forma completa y el diseño deuna construcción que presente las regiones de mayor inmunogenicidad, con el fin de generar antígenos que permitanestablecer un ensayo serológico para determinar la identidad del agenteetiológico en un cuadro de infección flaviviral.En este trabajo se utilizaron cepas regionales de los virus St. LouisEncephalitis, West Nile,Yellow Fever, Zika y Dengue para el desarrollo de las siguientesactividades: predicción bioinformática de las regiones inmunogénicas, diseño de construccionesy primers, obtención de ARN viral, síntesis de ADNc, amplificación de losfragmentos de interés, clonado de los productos de amplificación, transferenciaa los vectores de expresión, ensayos de expresión, purificación y estudioantigénico de las proteínas mediante WesternBlotting y ELISA. Las regiones codificantes propuestas fueron empleadas para su inserciónen vectores de expresión pET, dando lugar a la generación de una proteínarecombinante unida a un tag de histidinas. Además, como una alternativa a laproteína completa, se realizaron las predicciones de sitios de mayorinmunogenicidad de NS1 SLEV y se diseñó una construcción que permitie la expresión de varios epítopes separados por residuos de glicinas, teniendo ademásla opción de combinar los diferentes constructos para obtener una mayorrespuesta.Lascondiciones de expresión fueron optimizadas para las distintas proteínas, y laidentidad confirmada a través de Western Blotting con sueros específicos y consueros comerciales que reconocen el tag. Finalmente, se realizaron lasoptimizaciones a los proceso de purificación de las proteínas y su posteriorempleo para la adhesión a las placas multipocillos. Al comenzar a emplearsueros específicos pudo observarse que los antígenos son reconocidos por en esteformato, restando aún definir los valores de corte para cada caso, ya que enese caso es necesario contar con una amplia batería de muestras de pacientes.Asimismo, se espera poder ensayar varios formatos de RDTs, como captura de anticuerpoen los formatos directo y sandwich, la captura de antigeno y la determinacionde avidez para diferenciar infecciones primarias o secundarias.