Expresión heteróloga de la proteína L1 del Virus Papiloma Humano para el desarrollo de un enzimoinmunoensayo

COLLADO MS; IGLESIAS NG; LORCH MS; ROTA PR

Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Congreso; XII Congreso Argentino de Virología, V Simposio de Virología Clínica, III Simposio de Virología Veterinaria; 2017

Asociación Argentina de Microbiología

El cáncer cervical es el segundo tipo de cáncer más común en las mujeres a nivel mundial. La infección persistente con diferentes tipos de virus papiloma humano (HPV,por Human Papilloma Virus) oncogénico, es un factor necesario para el desarrollo del mismo. Las vacunas que actualmente se encuentran en el mercado están basadas en la habilidad de la proteína de la cápside viral (L1), para formar partículas similares a virus (VLPs, por Virus Like Particles), las cuales se parecen en forma y tamaño a los viriones salvajes e inducen altos niveles de anticuerpos neutralizantes. La respuesta serológica frente a vacunas de HPV basadas en VLPs de tipo específicos es universal y los títulos de anticuerpos son muy superiores a los generados por la infección natural. Todavía no se conoce con exactitud la duración de la protección que confieren estas vacunas, aunque sí se conoce que los títulos de anticuerpos se mantienen significativamente por encima del título normal al menos 60 meses después de la vacunación.El objetivo de este trabajo es producir antígenos de HPV-16 que permitan desarrollar ensayos de detección serológica in house para el diagnóstico así como el seguimiento de la respuesta en la población vacunada.A partir de los datos de secuencia completas de la proteína L1 de HPV-16 obtenidos de GenBank, se llevó a cabo un alineamiento que fue posteriormente empleado para la predicción bioinformática de las regiones inmunogénicas y el diseño de los primers. A partir de muestras de pacientes con HPV-16 positivo se amplificaron diferentes versiones de L1. Luego de su amplificación fueron insertadas en un vector de clonado y transferidas al vector de expresión pGEX-5X-1, dando lugar a una fusión a GST (Glutathione S-transferase) en su extremo amino, lo cual debería impactar positivamente en la producción y solubilidad de estas proteínas recombinantes. De esta forma, se generaron 6 variantes donde se abarcan de forma escalonada y desde el N terminal los distintos epítopes descritos en bibliografía. Las mismas son denominadas GST-L127, GST-L140, GST-L148, GST-L160, GST-L171, GST-L180 y GST-L183. Es importante destacar que esta última proteína representa nuestra secuencia de base, y presenta la deleción del los primeros 30 residuos, ya que constituyen la región hidrofóbica de la proteína, pudiendo influir negativamente en su expresión. Una vez obtenidas todas las construcciones se llevó a cabo la optimización de la expresión y purificación de las mismas, procediendo luego a la caracterización antigénica de las mediante Western Blotting y enzimoinmunoensayo (EIE).De esta forma, fue posible observar la detección de las distintas variantes empleando tanto sueros de pacientes y comerciales para GST, a través de Western Blotting. Por otro lado, se optimizó un EIE, determinando las condiciones óptimas para la adhesión de los antígenos al soporte de placa multipocillo, y observando respuestas diferenciales dependiendo del o los epítopes abarcados.