Producción de antígenos recombinantes para el diagnóstico serológico de Flavivirus de importancia regional.

LORCH MS; COLLADO MS; ROTA PR; ARGUELLES MH

Buenos Aires

Congreso; XVIII Simposio Internacional sobre Enfermedades Desatendidas; 2017

Fundación Mundo Sano

Introducción: El diagnóstico para Flavivirus está fuertemente centrado en el empleo de ensayos serológicos, ya sea de forma directa (determinación de antígenos tempranos), o indirecta (determinación IgM o IgG en suero o LCR de pacientes). Sin embargo, los ensayos serológicos no suelen contemplar el complejo escenario de Flavivirus presente en la región, perdiendo especificidad, con lo que se debe recurrir a técnicas más complejas como la neutralización [1].Esta situación plantea la necesidad de desarrollar métodos de diagnóstico sencillos que permitan diferenciar una infección producida por estos agentes virales. El objetivo de este trabajo se centra en la expresión de la proteína recombinante NS1 de flavivirus en su forma completa y las regiones de mayor inmunogenicidad, con el fin de generar antígenos que permitan establecer un ensayo serológico para determinar la identidad del agente etiológico en un cuadro de infección flaviviral.Materiales y Métodos: En este trabajo se utilizaron cepas regionales de los virus St. Louis Encephalitis, West Nile, Yellow Fever, Zika y Dengue para el desarrollo de las siguientes actividades: predicción bioinformática de regiones inmunogénicas, diseño de construcciones y primers, obtención de ARN viral, síntesis de ADNc, amplificación de los fragmentos de interés, clonado de los productos de amplificación, transferencia a los vectores de expresión, ensayos de expresión, purificación y estudio antigénico de las proteínas mediante Western Blotting y ELISA.Resultados y Discusión: Las regiones codificantes propuestas se incertaron en vectores de expresión pET, dando lugar a la una proteína recombinante unida a un tag de histidinas. Se realizaron las predicciones de sitios de mayor inmunogenicidad de NS1SLEV y se diseñó una construcción que contiene varios epítopes separados por residuos de glicinas. Las condiciones de expresión fueron optimizadas para las distintas proteínas, y la identidad confirmada a través de Western Blotting. Se realizó la optimizacion de los pasos de purificación de las proteínas y la adhesión a las multiplacas. Empleando sueros específicos pudo observarse que los antígenos son reconocidos por en este formato, restando aún definir los valores de corte para cada caso, para lo cual es necesario contar con una amplia batería de muestras de pacientes. Asimismo, se espera poder ensayar varios formatos de ELISA, como captura de anticuerpo en los formatos directo y sandwich, la captura de antigeno y la determinacion de afinidad para diferenciar infecciones primarias o secundarias.Bibliografía:[1] Galula et al. (2015) ?Establishment of an Algorithm Using prM, E-and NS1-specific IgM Antibody-Capture ELISAs in Diagnosis of Japanese Encephalitis Virus and West Nile Virus? J Clin Microbiol. Feb;54(2):412-22.