OPTIMIZACION DE UN ELISA INDIRECTO PARA CUANTIFICAR ANTICUERPOS BOVINOS CONTRA PARAINFLUENZA VIRUS 3

ECHAGUE H; GARCÍA S; MAIDANA, S; RODRIGUEZ A; ODEON M; PARREÑO V; ROMERA, S.A.

Encuentro; XXI REUNIÓN CIENTÍFICO TÉCNICA AAVLD Dr bernando Jorge carrillo; 2016

IntroduccionParainfluenza virus tipo 3 (PIV3) es un virus envuelto de ARN simple cadena y polaridad negativo, pertenece al género respirovirus y a la familia Paramixoviridae. Este virus ocasiona graves pérdidas en términos de morbilidad y reducción de la producción en el ganado vacuno (Ellis, 2010). En nuestro país la infección por PIV3 fue detectada por evidencia serológica en la década del 80?. Relevamientos serológicos realizados en la década del 2000 en rodeos bovinos no vacunados de Jujuy y Neuquén indicaron que el 100% de los bovinos adultos resultaron seropositivos para anticuerpos contra este agente viral. La técnica gold standard para la determinación de anticuerpos anti PIV3 es la inhibición de la hemoaglutinación (IH), sin embargo, esta técnica resulta poco efectiva por su falta de objetividad. Por lo tanto, se describe en el presente trabajo la optimización de un ELISA indirecto (se amplificó el antígeno viral en células RK13 para evaluar anticuerpos contra PI3 en sueros bovinos. Para establecer el punto de corte se realizó una curva de frecuencia con sueros positivos y negativos de historia conocida. Materiales y MétodosLa cepa de referencia SF4 de PI3 se multiplicó a partir de un virus semilla, en frascos con monocapas de células de riñón de conejo (RK13) a 37°C con 5% CO2. Se inoculó 1 ml del virus semilla, se adsorbió por 1 hora a 37°C y posteriormente se agregó medio de cultivo mínimo esencial de Eagle (MEM-E, Gibco). La infección se dejó progresar durante 24 horas hasta detectar un 80% de la monocapa afectada, para congelar a - 70°C inmediatamente. Purificación viral para antígenoLas células infectadas RK13 fueron lisadas mediante 3 ciclos de congelación y descongelación. Después de una centrifugación inicial a 3000g durante 15 minutos, se añadieron a los lisados celulares polietilenglicol 8000 (Sigma) 10%. Se incubó durante 4 horas a 4ºC. El virus se sedimentó a 12000g durante 60 minutos a 4ºC. El pellet se resuspendió en 2.5 ml de buffer NET y 2.5 ml de Glicerol. Finalmente se fraccionó el antígeno y se conservó a -20ºC.Optimización de un ELISA indirecto para evaluar anticuerpos contra PI3 en sueros bovinosSe optimizó el ELISA indirecto para cuantificar anticuerpos contra PI3 en sueros bovinos amplificando el virus PI3 en células RK13. Se evaluó y seleccionó esta línea celular para disminuir el pegado inespecífico de anticuerpos a antígenos celulares que se observaba cuando se amplificaba en MDBK reportado previamente (Maidana, 2013).Determinación de punto de corte y cuantificación de anticuerpos bovinos mediante ELISA indirecto.Para establecer el nuevo punto de corte en el ELISA indirecto optimizado utilizando células RK13 se testearon sueros bovinos de historia conocida.Se sensibilizaron 24 horas a 4°C placas Inmulon IB con el antígeno amplificado en RK13. El bloqueo se efectuó con 50 μl de buffer PBS-T ovoalbúmina 1% p/v (PBS-T OVA 1%) durante media hora a 37°C con agitación constante. Se efectuaron tres lavados. Posteriormente, los sueros se agregaron a la placa en una dilución (1:40), en PBS-T OVA 1 % y se incubaron 1 hora a 37°C con agitación. Se efectuaron tres lavados sucesivos y se agregó un anticuerpo anti bovino conjugado con peroxidasa (HRP, horse radish peroxidase - Kirkegaard & Perry Laboratories, KPL) en una dilución (1:2000) durante una hora. Se procedió al revelado utilizando agua destilada, peróxido de hidrógeno y el cromógeno orto-fenildiamina (OPD) (Sigma). Luego de 10 minutos la reacción fue frenada agregando ácido sulfúrico. La absorbancia se midió a 490nm (A490) en un lector de ELISA (Multiskan FC). ResultadosPara determinar el punto de corte se corrieron 80 sueros de historia conocida, 50 sueros positivos y 30 sueros negativos a PI3. El 93% de los sueros negativos tuvieron D.O.C menores a 0.2 y el 78 % de los sueros positivos tuvieron D.O.C entre 0.35 y 0.8 Determinandose el punto de corte como el menor valor de absorbancia a partir del cual se considera un suero positivo, en este caso es de 0.3.El punto de corte se determinó en una densidad óptica corregida mayor o igual a 0.3? a partir de la cual se consideran los sueros positivos. DiscusiónSe optimizó el ELISA indirecto previamente desarrollado (Maidana, 2013) para cuantificar anticuerpos contra PI3 en sueros bovinos amplificando el virus PI3 en células RK13, de esta manera se logró disminuir notablemente el background observado en la estandarización previa donde se amplificaba el virus en MDBK. Para mantener los mercados comerciales internacionales, la determinación de la seroprevalencia y la vacunación de los rebaños serán obligatorias en un futuro cercano. El ELISA desarrollado aquí representa una técnica complementaria a la IH para determinar anticuerpos contra PIV3 de bovinos.Por otro lado dado la reciente resolución de SENASA N? 598/2012donde se exige el control inmunogénico en modelo cobayo de vacunas virales inactivadas no vesiculares para bovinos resultará de interés el desarrollo de ELISA para cuantificar sueros de cobayos contra PI3 inducidos por dichas vacunas y correlacionarlos con los títulos obtenidos por las mismas vacunas en el bovino determinadas por el ELISA bovino. El ELISA desarrollado resulta una técnica rápida, cuantitativa y complementaria a la IH para cuantificar anticuerpos contra PIV3 de bovinos y podría estar disponible comercialmente en el país en un futuro cercano.Bibliografia-Maidana S, Ferrufino C y Romera S. Desarrollo de un ELISA indirecto para cuantificar anticuerpos bovinos contra parainfluenza virus 3. Revista de la Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales. ISSN 0328-6312 .N° 11, 2013. Universidad de Morón, Argentina-ELLIS, J.A., 2010. Bovine parainfluenza-3 virus. The Veterinary clinics of North America 26, 575-593.