Desarrollo de una técnica molecular para la rápida detección y subtipificacion de aislamientos de BoHV1

MAIDANA, SS; CRAIG MI; RE, JI; ODEON MM; ROMERA, SA

Simposio; XXXVI Reunión Científica Anual Sociedad Argentina de Virología; 2016

Introducción: BoHV1 es un patógeno difundido en todo el mundo, con diferencias en la incidencia y la prevalencia a nivel geográficas. Todos los aislados de BoHV1 se clasifican en tres subtipos BoHV1.1, BoHV1.2a y BoHV1.2b. Tradicionalmente, la diferenciación entre subtipos se basó en las características clínico-epidemiológicas del brote seguido por el análisis de restricción enzimática del genoma viral (REA) de los aislamientos. El REA es particularmente útil para diferenciar a los BoHV1 de los diferentes alfaherpesvirus de rumiantes antigénicamente relacionados y a su vez diferenciar entre subtipos, pero es una técnica que requiere del aislamiento seguido de un protocolo laborioso para la obtención de gran cantidad y calidad de ADN viral. Objetivo: El objetivo de este trabajo fue desarrollar una técnica molecular económica, rápida y fácil que permite la detección y diferenciación de todos los subtipos BoHV1. Metodología: Los virus utilizados en este estudio fueron aislamientos de campo y cepas de referencia de BoHV1. El estudio in silico con herramientas bioinformáticas reveló que los sitios de restricción que determina los diferentes patrones entre los subtipos se incluyen en los marcos abiertos de lectura de la UL38 y US3. A partir de estos resultados se diseñaron cebadores basándonos en la secuencia de BoHV1 (Genbank n°: NC_001847.1) (UL39F: 5-TCGTCGAAGAGCGTCCACACA 3-nt 24783 y UL39R: 5-ACCGCGCTGTACCGGCAGCT-3 nt 25275; US3F: 5-TACAAATCGGCGGCGCCAAA-3 nt 115134 y US3R: 5-TTGTTGACGGCCAAGTATAA-3 nt 115834). El ensayo desarrollado fue una PCR multiplex REA que consiste en una reacción de PCR que incluye dos pares de oligonucleótidos que amplifican 2 fragmentos de 700 (US3) y 550 pb (UL39). Los productos de la PCR luego son digeridos con la enzima HindIII y sometidos a una corrida electoforetica en gel de agarosa de 2% y finalmente visualizadas las diferentes combinaciones de clivado bajo luz UV. Resultados: La secuenciación de de los sitios de restricción UL39 y US3 indican las siguientes mutaciones: UL39 aagctt/aagctA y en el sitio US3 aagctt/aCgctt. En el subtipo 1.1 si bien se amplifican las bandas estas no se clivan y para el caso del subtipo 1.2a solo se cliva el fragmento de 700 pb en 2 uno de 440 y otro de 260 pb. Para el subtipo 1.2b se cliva además del de 700 pb el fragmento de 550 en 300 y 250 pb. Se analizaron con esta nueva técnica 55 aislamientos de campo que habían sido subtipificados previamente con la técnica gold standart (REA de genoma completo) obteniéndose el 100% de correlación entre ambas técnicas. Conclusiones: La identificación de subtipos es relevante para entender la variabilidad genética del virus particularmente en nuestro país donde las infecciones por BoHV1/5 y BuHV1 son endémicas, contribuyendo así a los estudios de epidemiología molecular de los alfaherpesvirus de rumiantes. La PCR multiplex-REA que se describe en este trabajo proporciona una nueva herramienta para el diagnóstico rápido de subtipos de BoHV1.