OBTENCIÓN DE CINCO GENOMAS COMPLETOS DE BuHV-1 (HERPESVIRUS BUBALINO 1) POR NEXT GENERATION SEQUENCING (NGS) AISLADOS EN ARGENTINA

MAIDANA SILVINA S.; ANA MARANDINO; JOSE LUIS KONRAD; YANINA PANZERA; RUBEN PEREZ; ALEJANDRA ROMERA

Auncion

Simposio; 10° Simposio de Búfalos de las Américas y Europa; 2022

APACRIBU

IntroducciónLa producción de búfalos de agua representa una importante alternativa económica en Argentina, que permite acceder a mercados nacionales e internacionales. Hoy Argentina tiene un stock de 200.000 búfalos de agua principalmente distribuidos en las provincias de Chaco, Formosa y Corrientes (Crudeli et al., 2021). Nuestro grupo estudia la circulación de alfaherpesvirus en rodeos bubalinos tantos de cepas virales propias de búfalos, así como también el rol que juega este hospedador en la epidemiologia de los alfaherpesvirus vacunos. Tal es así que aislamos cinco herpesvirus bubalinos caracterizados como BuHV-1. Uno de estos aislamientos fue además caracterizado en un ensayo experimental in vivo de infección y transmisión a vacunos vírgenes (Maidana et al., 2014 y 2016). Por lo tanto, para continuar con el estudio de estos virus bubalinos nos propusimos obtener sus genomas completos por NGS. MetodologíaCinco cepas de BuHV-1 aisladas (2028N, PC446V, A549V, A067Vy 84250V), obtenidas de búfalos de diferentes establecimientos en una feria de remate en el noreste de Argentina, las cuales se propagaron en células de riñón bovino Madin Darby (MDBK) y el ADN viral se extrajo de 200 µL de sobrenadante de cultivo (kit de ADN viral QIAamp; Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizó el kit DNA Prep (Illumina, EE. UU.) para la preparación de bibliotecas. Las bibliotecas se purificaron con AMPure XP (Benchman Coulter, EE. UU.) y se cuantificaron con un kit Qubit dsDNAHS (Invitrogen, EE. UU.). La calidad y la longitud de la biblioteca se evaluaron en un sistema Fragment Analyzer 5200 (Agilent Technologies, EE. UU.) utilizando el kit de análisis NGS de sensibilidad estándar (Agilent Technologies, EE. UU.). La secuenciación del genoma completo se realizó en una plataforma Illumina MiniSeq (Facultad de Ciencias, Uruguay) utilizando el cartucho de reactivos de salida media MiniSeqTM (300 ciclos, lecturas emparejadas). Las secuencias obtenidas se procesaron recortando los adaptadores y filtrando por calidad utilizando BBDuk y las lecturas se ensamblaron utilizando un genoma de referencia con el software Geneious Prime 2020.1.2 (https://www.geneious.com). Los genomas consenso se anotaron utilizando la cepa B6 del herpesvirus bubalino 1 y la cepa ISO97/45 de herpesvirus bovino tipo 5 (Accesión: KU936049.1 y KY549446.1). Las secuencias de nucleótidos se alinearon usando MAFFT v. 7.157b (Katoh y Standley, 2013). Los ORF individuales se extrajeron y luego se tradujeron usando EMBOSS Transeq (http://www.eb i.ac.uk/Tools/st/emboss_transeq/), y las secuencias de aminoácidos resultantes se alineado utilizando MAFFT v. 7.157b (Katoh y Standley, 2013). Los tamaños, estructura y contenido de GC de cada genoma fueron obtenidos y evaluados con el software Geneious Prime 2020.1.2 (https://www.geneious.com).Resultados y discusiónSe obtuvieron cinco genomas con una amplitud de cobertura mayor del 90%. Las secuencias genómicas completas de las cepas 20287N, A067V, PC446V, 84250V y A549V tienen un tamaño similar (aproximadamente 138 kb) y un contenido de GC de alrededor del 76%. La estructura de los genomas corresponde a los herpesvirus clase D, que consta de una región única larga y una corta (UL y US), ambas flanqueadas por repeticiones invertidas (IR y TR). En cuanto a la homología y número de genes se pueden distinguir 2 grupos de cepas, 20287N, PC446V y A067V similares a los BoHV-5 y las cepas 84250V y A549V similares al BuHV-1 australiano confirmándose los 2 linajes previamente reportados (Maidana et al, 2014) Las cepas tienen una homología genómica total del 98,3 al 99,3 %. La homología con otras cepas varía entre 92–96,8% (BuHV-1), 88,4–93,3% (BoHV-5) y 78,1–79,5 % (BoHV-1). Hasta donde sabemos, este es el primer reporte de obtención de genomas completos de herpesvirus bubalinos aislados en América del Sur. Hasta el momento solo un genoma completo (cepa B6 de BuHV-1 Australiana) se encuentra depositado y disponible en una de las bases de datos (GenBank). Una vez depositados nuestros genomas en la base de datos contribuiríamos fuertemente al conocimiento mundial de la diversidad genética de esta especie viral. Ninguno de los búfalos de donde se aislaron estos virus mostraron sinología aparente, pero cabe destacar que las muestras se obtuvieron de animales en remate justo después del transporte desde sus establecimientos al predio de remate y se sabe por bibliografía que el herpesvirus reactiva luego de condiciones de estrés agudo como el transporte, por lo que resulta importante que la persona responsable del embarque y transporte de búfalos debe tener conocimientos básicos del comportamiento y necesidades, a fin de reducir el estrés y minimizar los accidentes que llegarán a afectar la integridad física y salud de los animales (Torres Mignaquy, 2005).ConclusionesObtuvimos con éxito cinco genomas de BuHV-1 confirmándose la existencia de dos linajes circulante en la población bubalina Argentina. Conocer las especies virales de alfaherpesvirus circulantes en la población bubalina es relevante para la toma de decisiones políticas de salud para el sector productivo, el establecimiento de los reservorios de alfaherpesvirus patogénicos para otras especies como la bovina, y el conocimiento de la evolución viral en la familia de bóvidos. Referencias bibliográficasCrudeli G. Patiño E. Maldonado Vargas P. Konrad J. 2021. Los búfalos en Argentina. Rev vet. 32 (2): 169-173.Katoh K, Standley D.M. 2013. MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability. Mol. Biol. Evol. 30, 772–780. https:// doi.org/10.1093/molbev/mst010Maidana S.S. Konrad J.L. Craig M.I. Zabal O. Mauroy A. Thiry E. Crudel, G. Romera S.A. 2014. First report of isolation and molecular characterization of bubaline herpesvirus 1 (BuHV1) from Argentinean water buffaloes. Arch. Virol. 159: 2917–2923. http://dx.doi.org/10.1007/s00705-014-2146-8Maidana S. Delgadoa F. Vagnonia L. Mauroyd A. Thiry E. Romera S. 2016. Cattle are a potential reservoir of bubaline herpesvirus 1 (BuHV1). Veterinary Record Open. 12;3(1): e000162. doi: 10.1136/vetreco-2015-000162.Torres Mignaquy E. 2005. Manual de buenas prácticas en producción bubalina. Secretaria de agricultura, ganadería, pesca y alimentos. Dirección de ganadería, área bubalinos, p: 7-25.