ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO DE FIJACIÓN DE TEJIDO NERVIOSO Y EXTRACCIÓN DE DNA VIRAL A PARTIR DE TACOS DE PARAFINA

CIANFRINI, DANIELA; FRANCO, DIEGO; MORENO, CLAUDIA; BLANCOVIERA, JAVIER; MAIDANA, SILVINA; ROMERA, S. ALEJANDRA

Jornada; XXX Reunión científica anual de la sociedad Argentina de Virología”; 2010

Sociedad Argentina de Virología

El Herpesvirus bovino 5 (BoHV-5) es el agente etiológico de la meningoencefalitis afectando principalmente bovinos jóvenes y puede alcanzar un 100% de mortalidad. BoHV-5 guarda estrecha relación con Herpesvirus bovino 1 (BoHV-1). La alta homología de secuencia encontrada entre ellos y la falta de técnicas diferenciales interfieren en el conocimiento de la real seroprevalencia de BoHV-5. A su vez, los escasos aislamientos obtenidos impiden conocer la situación epidemiológica actual en nuestro país. El objetivo general de este trabajo es estandarizar la extracción de DNA desde muestras de tejido nervioso parafinado para determinar retrospectivamente la circulación de BoHV-5. Teniendo como objetivos particulares: A- Testear los distintos protocolos de extracción de DNA de tacos parafinados de la bibliografía sobre las muestras recolectadas (1990-2010) dentro del programa argentino de vigilancia de BSE (Encefalopatía espongiforme bovina). B-  Desarrollar un protocolo específico para proponer al programa de BSE que determine fijador y tiempo óptimo de fijación para la posterior extracción de DNA de BoHV-5 y su amplificación por PCR desde tejido nervioso parafinado. A-                 Para estandarizar la extracción y amplificación de DNA por PCR se utilizó tejido nervioso de bovinos infectados con BoHV-5 fijado en formalina (fijador de rutina) y conservado en tacos de parafina. B-                 Para comparar los distintos fijadores (etanol 96%, acetona y metanol puros y formalina bufferada 4 %) y los distintos tiempos de fijación (30 minutos, 1 hora, 2, 4 y 5 horas) se usaron tejidos de bovinos recién sacrificados y necropsiados. La detección de BoHV-5 se realizó por PCR de la proteína viral gC y como control interno de la técnica de extracción de DNA se amplificó un gen de mamífero (GAPDH). No se obtuvieron ácidos nucleicos de ninguna de las muestras parafinadas previamente fijadas con formalina independientemente del protocolo usado, del tiempo de digestión del tejido o de la antigüedad de las muestras; sin embargo se pudo extraer DNA de BoHV-5 de los mismos tejidos pertenecientes a los mismos animales pero sin fijar; de lo cual se desprende que el proceso de fijación del tejido es determinante en el éxito de la extracción de DNA. Cuando se evaluaron distintos fijadores y tiempos para proponer un protocolo específico se pudo corroborar que el etanol 96% es el fijador que permite la mejor extracción de DNA tanto celular como de BoHV-5 (seguido por la acetona y el metanol puros), y que el mejor tiempo de fijación para el volumen de muestra en estudio (entre 6 y 24 mm3) es 2 horas. La extracción a partir de tejidos fijados con formalina no arrojó un rendimiento satisfactorio. CONCLUSIÓN La formalina es el fijador más ampliamente utilizado en la práctica histopatológica; sin embargo, para el análisis molecular, ésta induce cross-linking entre el DNA y las proteínas, lo cual afecta la extracción de DNA y la amplificación por PCR arrojando en este estudio resultados negativos para todos los protocolos de extracción evaluados. El etanol 96% no causa dicho cross-linking y de acuerdo a nuestros resultados es el que permite la mejor extracción de DNA, por ende podría ser propuesto en el futuro como fijador de rutina para los programas que fijan tejido nervioso.