Factores que afectan la expresión transitoria del gen gus A en transformación de embriones inmaduros de cebolla mediada por Agrobacterium tumefaciens

GALMARINI, CLAUDIO; DELUCHI, BERNARDO; ROSSELLO, FERNANDO; RÍOS, RAÚL; FRANZONE, PASCUAL; CURVETTO, NÉSTOR

cABA

Simposio; V SIMPOSIO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA VEGETAL; 2002

REDBIO ARGENTINA ASOCIACIÓN CIVIL

El embrión inmaduro (EI) es un explante alternativo al embrión cigótico maduro(EC) y si bien resulta menos conveniente desde el punto de vista de la disponibilidad, tiene la gran ventaja de su gran potencial de regeneración en la variedad local Valcatorce INTA (1). Por esto realizamos ensayos de transformación de EI con Agrobacterium tumefaciens con el fin de ajustar el protocolo original descrito por Eady y colaboradores (2), con el que no obtuvimos resultados positivos anteriormente (3).MetodologíaLos EI de la variedad Valcatorce INTA se extrajeron cuando la cubierta seminal vira a color negro y el endosperma es pastoso. Los EI se transformaron inmediatamente después de extraídos o luego de 7 o 10 días de cultivo en medio de inducción de callos (BDSc) (1). La transformación se realizó con las cepas Agl1, C58 PGV 2260, EHA 105 o LBA 4404 de A. tumefaciens, todas portadoras de un vector binario que contiene el gen marcador visualizable gus A (gus intrón) bajo el control del promotor 35S. La bacteria se cultivó en medio MG/L (DO600 0,5 ? 0,7). Se usó la suspensión bacteriana en su mismo medio o se centrifugó 15 minutos a 2000 rpm y se reemplazó el sobrenadante por medio basal BDS. En todos los casos 30 minutos antes de la transformación se agregó acetosiringona (100 uM concentración final). Para la inoculación los EI se agitaron en 1 ml de suspensión bacteriana con vortex durante 10 segundos y se mantuvieron por 10 minutos hasta que se retiró la suspensión bacteriana, eliminando el exceso con papel absorbente estéril. Luego se pasaron a medio BDSc con 200 uM de acetosiringona. Al cabo de 4 días de cocultivo se determinó la expresión transitoria de la enzima β-glucuronidasa por cuantificación de puntos azules de 15 EC por cada tratamiento en cada una de las cuatro repeticiones de la experiencia.Resultados y DiscusiónLos EI sin precultivar mostraron baja eficiencia de transformación (4%) al igual que el año anterior (3), en cambio el precultivo de los mismos durante 7 días permitió lograr 30% de EI con expresión transitoria. El medio de cultivo bacteriano no afectó la transformación, produciendo una mayor proporción de EI con expresión transitoria que los transformados con bacterias resuspendidas en medio de cultivo de embriones. Las cuatro cepas evaluadas produjeron una alta proporción de EI con expresión alcanzando 100 % de EI con puntos azules transformados con Agl 1. ConclusionesSi bien el EI tiene una disponibilidad limitada en el tiempo y su obtención es más laboriosa, resultaría muy ventajoso su uso como explante blanco para la transformación en vista de la mayor expresión transitoria obtenida con respecto a los EC (3) sumada a su mayor potencial de regeneración.