Expresión transiente y estable de uid A en embriones cigóticos de cebolla

MARINANGELI, PABLO; DELUCHI, BERNARDO; CURVETTO, NÉSTOR

Goiania

Congreso; IV encuentro Latinoamericano de biotecnología Vegetal; 2001

Redbio

Recientemente se ha informado una metodología para la obtención de plantas transgénicas de cebolla a partir de embriones inmaduros. Idealmente, los transgenes de interés deben ser introducidos en cultivares agronómicamente superiores que sean susceptibles de ser introducidos en nuevos planes de mejoramiento con el objetivo de potenciar las características introducidas por esta biotécnica. El uso de embriones cigóticos maduros (EC) como explanto blanco para la transformación resultaría ventajoso por su tamaño reducido y por la fácil disponibilidad y conservación de las semillas. Los objetivos de este trabajo fueron: optimizar la expresión transitoria del gen reportero uidA en embriones cigóticos maduros de cebolla y ajustar la concentración del agente de selección geneticina para seleccionar células que expresen el gen NPT II. La variedad usada fue Valcatorce INTA (90% del área sembrada en Argentina). Los EC se transformaron inmediatamente después de extraídos o luego de una semana de cultivo en medio de inducción de callos con la cepa Agl1 de A. tumefaciens. Para la inoculación se agitaron los EC en 0,8 ml de suspensión bacteriana con vortex durante 20 segundos con o sin la presencia de microesferas de vidrio de 200 uM de diámetro. Al cabo de cuatro días de cocultivo se observó la expresión transitoria o se transfirieron los explantos a medio con 25, 50, 75 o 100 mg.L-1 de geneticina durante tres meses con repiques quincenales. Realizamos 17 transformaciones de entre 250 y 350 EC cada una durante toda la experiencia. Cultivando los EC siete días en medio de inducción de callos antes de la transformación se obtuvo el 38% de los EC con puntos azules y el 14% con más de cinco puntos, en comparación con los EC no precultivados que solo mostraron un 27% de EC con puntos azules y un 4% con más de cinco puntos (Figura 1). También encontramos que la agitación con microesferas de vidrio durante la inoculación mejoró sensiblemente la expresión transitoria: 67% de EC con puntos azules y 38% con más de cinco puntos. Un estudio microscópico muestra que en los EC sin precultivar no hay espacios intercelulares entre las células epidérmicas y que éstas están cubiertas por una capa mucilaginosa densa (Figura 2-A). En los EC cultivados durante una semana la epidermis se encuentra rasgada y se observan nuevos grupos de células emergiendo, seguramente más suceptibles de ser iunfectadas por A. tumefaciens (Figura 2-B y C). La mayor eficiencia de transformación cuando los EC son agitados con microesferas de vidrio durante la inoculación pudo deberse al efecto de barrido de la capa mucilaginosa que los envuelve y no a la lesión que inflingen las microesferas a las células (Figuras 2-D y E). El cultivo con geneticina no permitió seleccionar callos resistentes en ninguna concentración, encontrándose sólo algunos escapes en las concentraciones 25 y 50 mg.L-1 (0.66 y 0.83 % respectivamente). La etapa de selección in vitro es crítica y debe ser ajustada, posiblemente usando concentraciones muy bajas durante los primeros repiques, aumentándola luego.