Rol de factores de transcripción megacariocíticos en la producción plaquetaria

GLEMBOTSKY AC.; BENEDETTI L; MARTA R.; RASLOVA H.; PODHAJCER O.; MOLINAS FC.; HELLER PG.

Jornada; X Jornadas Científicas del Instituto de Investigaciones Médicas Alfredo Lanari; 2011

La regulación molecular de la producción plaquetaria se conoce en forma parcial. El estudio de pacientes con desórdenes plaquetarios causados por mutación de factores de transcripción megacariocíticos constituye una oportunidad para estudiar este proceso.Previamente hallamos disminución del receptor de Trombopoyetina, c-mpl, y del factor regulador de la trombopoyesis, NF-E2, en pacientes con Trombocitopenia Hereditaria causada por mutación del factor de transcripción RUNX1, comprobándose posteriormente que ambos son blancos del RUNX1 en el megacariocito (MK). Con el fin de identificar nuevos reguladores de la producción plaquetaria entre los genes regulados por RUNX1, se inhibió la expresión del factor de transcripción ID1, el cual se halló disminuido en estos pacientes y cuyo rol en la megacariocitopoyesis no ha sido investigado. Se realizó silenciamiento de ID1 en progenitores hematopoyéticos CD34+ de cordón umbilical mediante ARN de interferencia, evaluándose el efecto en la megacariocito y trombopoyesis. Se construyeron vectores lentivirales conteniendo sh(short hairpin)RNA dirigido hacia ID1 y el marcador de selección green fluorescent protein(GFP) y se produjeron lentivirus shRNA-ID1 y shRNA-control en línea celular 293FT. Se purificaron células CD34+ por columnas inmunomagnéticas, se estimularon con citoquinas y transducidas con lentivirus, la eficiencia de transducción fue 26% en cultivos shRNA-ID1 y 21% en cultivos control. Una vez purificada esta población mediante cell sorting de CD34+GFP+(pureza 95% y 92%, respectivamente), se cultivó con Trombopoyetina para inducir la diferenciación hacia el linaje MK. Se halló inhibición de la diferenciación hacia MK (marcador CD41) de las CD34+ transducidas con shRNA-ID1 respecto al control, 64,1% vs 70,8% CD41+, y disminución de la maduración MK, evidenciada por % MK maduros (doble positividad para los marcadores CD41 y CD42b), 29,2% vs 41,6% CD41+CD42b+, y por la intensidad de fluorescencia (Gm) CD42b, 41,3 vs 61,3. Contrario a lo observado en la megacariocitopoyesis, no se halló inhibición de la trombopoyesis, número de MK formadores de proplaquetas en cultivos shRNA-ID1 vs control, 16 vs 13. A pesar de la inhibición en la megacariocitopoyesis observada con el ARN de interferencia anti-ID1, no se halló la disminución esperada del ARNm para ID1 mediante PCR en tiempo real en células CD34+ transducidas con shRNA-ID1 vs control, ΔCt ID1-GAPDH 4,96 vs 4,90. Se evaluará si el bloqueo observado en el MK se debe a un efecto del shRNA en la traducción proteica de ID1. En conclusión, considerando la dificultad existente en la transfección de CD34+ y MK, esta metodología resultó adecuada para evaluar el efecto del silenciamiento génico en MK primarios. La inhibición observada en la megacariocitopoyesis sugeriría un posible rol de ID1 en este proceso, cuyo significado en la regulación de la producción plaquetaria será definido en estudios en curso.