Rol de la vía de la miosina en el efecto del anagrelide sobre el megacariocito

ESPASANDIN YR.; GLEMBOTSKY AC.; MARTA RF.; LEV PR.; MOLINAS FC.; HELLER PG.

Jornada; XII Jornadas Científicas del Instituto Alfredo Lanari; 2013

El anagrelide (ANA) se utiliza en el tratamiento de la trombocitosis y la prevención de trombosis en la Trombocitemia Esencial, aunque los mecanismos por los cuales este fármaco disminuye las plaquetas no son claros. La producción plaquetaria involucra la diferenciación y maduración del megacariocito (MK) a partir de progenitores hematopoyéticos, fase conocida como megacariocitopoyesis, seguido por la formación de proplaquetas y plaquetas a partir del MK maduro, evento que se completa en pocas horas y se denomina trombopoyesis. Ambas etapas presentan mecanismos regulatorios independientes. Previamente demostramos que además de inhibir la megacariocitopoyesis, efecto ya conocido, el ANA bloquea la fase final de trombopoyesis, explicando su rápido inicio de acción. Hemos establecido que el efecto de esta droga sobre el MK es independiente de su actividad inhibitoria de fosfodiesterasa, única acción farmacológica conocida del ANA y responsable de la toxicidad cardiovascular, sugiriendo que los mecanismos subyacentes al efecto terapéutico difieren de los responsables de uno de sus principales efectos adversos. En este trabajo, postulamos que el ANA activaría la vía de la miosina, uno de los pocos reguladores negativos que modula simultáneamente la megacariocito y trombopoyesis, lo cual explicaría la acción inhibitoria del ANA sobre los mismos. Para evaluar esta posibilidad, estudiamos el efecto del inhibidor de miosina, blebistatina (Bleb), en la acción del ANA sobre el MK y estudiamos el estado de fosforilación de la cadena regulatoria de la miosina, principal activador de esta vía. Para ello, se utilizó un modelo de cultivo de megacariocitos derivados de progenitores hematopoyéticos de cordón umbilical estimulados con trombopoyetina e IL-6. Se evaluó la megacariocitopoyesis mediante la expresión de los marcadores CD61 (marcador de linaje megacariocítico) y CD42b (marcador de maduración) por citometría de flujo y mediante la clasificación morfológica de los MK según la complejidad nuclear o polilobulación en estadíos I-III, luego de la inmunofluorescencia CD61 y Hoechst. La incubación con Bleb 20µM durante los días 7-10 de cultivo indujo polilobulación en los cultivos sin ANA y parcialmente en cultivos con ANA 500hM, MK estadío II+III en control (C), ANA, Bleb y Bleb+ANA, 7.89±3.18, 5.92±3.76, 48.3±27.4, 26.8±10.4%, respectivamente, p=0.02 (p0.05, sugiriendo desacople entre maduración y poliploidización. La trombopoyesis se evaluó mediante la cuantificación del % de MK formadores de proplaquetas por observación en microscopio invertido al final del cultivo. El tratamiento de MK maduros (día 13) con Bleb revirtió parcialmente la inhibición del ANA sobre la trombopoyesis, que alcanzó los niveles obtenidos en el control pero no los obtenidos con Bleb sola, % proplaquetas en C, ANA, Bleb y Bleb+ANA 2,1±0,9%, 0,86±0,2%, 4,81±0,4%, 2,57±0,07%, respectivamente, p