Determinación de fosfatasa ácida (APH) para evaluación de viabilidad celular en esferoides tumorales.

MARÍA L. GIL CARDEZA; MARCELA S. VILLAVERDE; URSULA A. ROSSI; GERARDO C. GLIKIN; LILIANA M. E. FINOCCHIARO

Jornada; XXVI JORNADAS NACIONALES DE ONCOLOGIA DEL INSTITUTO “ÁNGEL H. ROFFO”; 2010

Los esferoides (ESF) constituyen un modelo de complejidad intermedia entre los cultivos en monocapa (MC) y los tumores in vivo. Estos recrean más fielmente que la monocapa las áreas pobremente oxigenadas y la resistencia multicelular, superando muchas de las diferencias en la respuesta a tratamientos citotóxicos observada entre las células creciendo en monocapa y los tumores in vivo. Sin embargo, su estructura tridimensional presenta inconvenientes metodológicos para medir la respuesta a los tratamientos principalmente por dos razones: i) el lavado es muy dificultoso cuando se utilizan técnicas no enzimáticas (i.e.: proteínas) , y ii) un  método enzimático como el MTS da resultados incoherentes cuando el tratamiento modifica la geometría del esferoide (posiblemente porque determina la actividad de células en la superficie de la esfera que son las más expuestas al sustrato). La restricción espacial de los ESF podría disminuirse midiendo la actividad enzimática de la fosfatasa ácida (APH), presente en los lisosomas celulares, que se realiza en presencia de 0,05% de Tritón-X100 (hecho que aumenta las posibilidades de penetración del sustrato en el interior del esferoide) y que se detiene con el agregado de NaOH (1 N). Este último disgrega los ESF, liberando el producto que podría haber quedado atrapado en el interior. Para evaluar el ensayo de APH como método para la medición de viabilidad celular en nuestro modelo tumoral, se sembraron cantidades crecientes de células de 4 líneas tumorales derivadas de melanoma espontáneo canino (Ak, Bk, Br y Rk), creciendo como MC y ESF. Las MC fueron reveladas 18 horas después de la siembra mediante 4 técnicas: 2 enzimáticas (APH y MTS) y 2 no enzimáticas (Bradford y Cristal Violeta), mientras que los ESF fueron revelados con las 2 metodologías enzimáticas al día 12 del sembrado de las células en placas de 96 pozos con fondo de agar (1,5%). Se calculó el coeficiente de correlación lineal de las curvas (R2); en 3 de las 4 MC ensayadas el mayor R2 se obtuvo para las curvas reveladas con APH (Bk: 0,997; Br: 0,999 y Rk: 0,995; n = 6) mientras que para la MC restante el coeficiente más alto se obtuvo con la técnica MTS (Ak: 0,996; n = 6). Cuando las células crecieron como ESF, las 4 líneas ensayadas obtuvieron el mayor R2 en las curvas reveladas con APH (Ak: 0,977 vs 0,926 n = 5; Bk: 0,955 vs 0,9145 n = 6; Br: 0,986 vs 0,965 n = 5; Rk: 0,9972 vs 0,8651 n = 5). Los resultados permiten concluir que la técnica de APH resulta la más apropiada para medir la viabilidad de los esferoides en nuestro modelo tumoral de líneas derivadas de melanoma espontáneo canino.