Detección de la expresión del gen CYP1A1 de Cyprinus carpio mediante técnicas moleculares como herramienta diagnóstica de calidad ambiental.

FERNANDO R. DE LA TORRE; CALAMANTE; GABRIELA

Neuquen, Argentina

Congreso; XV Congreso Argentino de Toxicología; 2007

Asociación Toxicológica Argentina

La inducción de la expresión del gen CYP1A1 puede ser evaluada mediante la actividad de la Etoxiresorufin-o-deetilasa sin embargo esta metodología puede verse afectada en presencia de algunos xenobióticos o por inactivación de la enzima. En este contexto, las técnicas moleculares permiten evaluar de manera específica la expresión a nivel de ARNm y proteína superando gran parte de dichas desventajas. El objetivo de este trabajo fue obtener herramientas moleculares que permitan evaluar los niveles de expresión del gen CYP1A1 para utilizarlas como biomarcadores de exposición. Para ello se evaluaron las técnicas de RT-PCR, Northern y Western blots, y dot-blot de ARN en carpas (C. carpio) expuestas a β-naftoflavona (β) un inductor específico del gen CYP1A1 Se inyectaron carpas juveniles con β, a las 48 h se extrajeron los hígados, se purificó el ARN total y mediante transcripción reversa (RT) se obtuvo el ADNc. Luego, utilizando primers específicos se logró amplificar por PCR un fragmento de ADN del tamaño esperado (1,1 kpb). La presencia de este fragmento sólo se detectó en los peces tratados (β) y, mediante RT-PCR semicuantitativa, se estimó un aumento de 100 veces en la expresión del gen a nivel transcripcional. Además, usando el fragmento de 1,1 kpb como sonda se detectaron por Northern y dot blots los niveles de expresión del ARNm en los peces expuestos a β. Por otro lado, dicho fragmento fue subclonado en vectores de expresión bacteriana para producir la proteína CYP1A1 recombinante que, inoculada en ratones, permitió obtener un antisuero específico. Utilizando este suero y mediante la técnica de Western blot se observó la presencia de una banda de 60 KDa correspondiente a CYP1A1 solo en los peces inyectados con β. La expresión de la proteína CYP1A1 también se detectó en ejemplares expuestos in situ en ambientes poluídos. Además, la inducción de esta proteína se detectó en especies nativas (C. paleatus, H. commersoni; L. obtudensis) en ensayos con β y en ejemplares colectados en campo. Los resultados obtenidos demuestran que las herramientas moleculares diseñadas pueden ser usadas como biomarcadores para detectar específicamente la inducción de la expresión del gen CYP1A1 en los monitoreos de calidad ambiental.  Financiamiento; PICT 2002-11225 y PIP 6467-CONICET.