OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS POLICLONALES ESPECÍFICOS DIRIGIDOS CONTRA LA PROTEÍNA CYP1A DE CYPRINUS CARPIO

FERNANDO R. DE LA TORRE; SALIBIÁN, A.; CALAMANTE; GABRIELA

Cordoba

Congreso; XIII Congreso Argentino de Toxicología; 2003

Asociación Toxicologica Argentina

El citocromo P4501A1 es una monoxigenasa microsomal (~55 kDa) que cataliza el primer paso de la biotransformación de diversos xenobióticos.  La inducción de la expresión del gen CYP1A puede ser seguida por la medición catalítica de la EROD o por técnicas de inmunodetección mediante anticuerpos específicos. En este trabajo se reporta la obtención de un antisuero específico para evaluar los niveles de expresión de la proteína CYP1A en la carpa Cyprinus carpio y utilizarlo como biomarcador de exposición.      El inserto del plásmido pGemPCR24, que corresponde a un fragmento de 1.1 kb del ADNc de CYP1A obtenido previamente, se subclonó en un vector de expresión bacteriana (pRsetB, Invitrogen) donde, por la estrategia de clonado se agregan 6 histidinas en el extremo aminoterminal de la proteína recombinante (CYP1Ar). Las bacterias recombinantes que poseían el plásmido pRSetCYP expresaban una proteína diferencial con la movilidad electroforética esperada, que era reconocida por el anticuerpo monoclonal dirigido contra el tracto de 6 histidinas (Invitrogen). Con el propósito de obtener un antisuero específico, las proteínas expresadas en E. coli BL21 se purificaron por electroelución, se inocularon en ratones y la presencia de anticuerpos específicos contra CYP1Ar se detectó a distintos tiempos post-inmunización mediante la técnica de Western Blot. Posteriormente, se determinó el grado de especificidad del antisuero obtenido en carpas, inyectadas o no con b-naftoflavona, un inductor de la CYP1A. Sólo en los peces tratados con el tóxico se observó la presencia de una banda diferencial correspondiente al tamaño reportado para la CYP1A utilizando el suero policlonal producido en ratón.      El antisuero específico dirigido contra la CYP1A de Cyprinus carpio obtenido podrá ser utilizado como biomarcador en ensayos de laboratorio y en evaluaciones a campo.