Evaluación de la expresión de CYP1A de Cyprinus carpio mediante técnicas moleculares

FERNANDO R. DE LA TORRE; SALIBIÁN, A.; CALAMANTE; GABRIELA

Buenos Aires

Congreso; VI Reunión Anual de SETAC Latinoamérica; 2003

SETAC Latinoamerica

El sistema citocromo P450 tiene un papel fundamental en la biotransformación de numerosos compuestos endógenos y exógenos. Desde el punto de vista ecotoxicológico, el citocromo P450 1A (CYP1A) es la isoforma mas importante y en los peces puede ser inducida por varios poluentes orgánicos.  En particular, la inducción de la síntesis de novo de las proteínas de la CYP1A por exposición a varios PAHs ha sido reportada por diversos autores. La comprobada utilidad de este sistema como biomarcador de exposición confiere además una interesante posición de estas enzimas dentro de la toxicología acuática. El objetivo de este trabajo fue la evaluación de la inducción de la expresión del gen de CYP1A1 en Cyprinus carpio expuestos a b-naftoflavona (bNF, tóxico de referencia) mediante RT-PCR, dot-blot de ARN y Western blot.  Juveniles de Cyprinus carpio fueron inyectados con 50 mg de bNF/kg de peso corporal. A las 48 hs post inoculación, se extrajeron muestras de hígado y se procesaron para la purificación de ARN y proteínas con el reactivo de Trizol (Invitrogen). La presencia del ARNm de CYP1A fue evaluada mediante dot-blot donde diferentes cantidades de ARN extraídos de peces (tratados o no con bNF) se inmovilizaron en membranas de nylon, se hibridizaron con una sonda radioactiva específica correspondiente a 1,1 kb del ADNc de CYP1A y se revelaron por autorradiografía. Sólo en los peces tratados se observó la presencia de una señal positiva que indicaría la inducción de la transcripción del gen CYP1A frente al tóxico. Mediante RT-PCR semicuantitativa se determinó que el incremento de la transcripción en los peces tratados fue de 10 a 100 veces superior que en los controles. Además, en las mismas muestras se evaluó la presencia de la proteína CYP1A por Western blot utilizando anticuerpos policlonales específicos obtenidos previamente. La inyección de bNF en los peces resultó en la inducción de una única banda de aproximadamente 58-60 kDa correspondiente a la CYP1A. Los resultados obtenidos indican que las técnicas moleculares evaluadas pueden ser utilizadas como herramientas apropiadas para el estudio de la inducción del gen de CYP1A en peces expuestos a inductores específicos.  Estas técnicas moleculares en Cyprinus carpio permiten también su consideración en bioensayos de laboratorio y en estudios de monitoreo ambiental al igual que la implementación de futuros estudios con otras especies test.