Genotipificación simultánea en un solo tubo de las mutaciones G20210A en el gen de protrombina (F II G20210A) y G1691A en el gen del factor V (factor V Leiden G1691A) por PCR en tiempo real.

SERAVALLE ANALÍA; SFALCIN JAVIER; BAQUEDANO MARÍA SONIA; FAY FABIAN

Rosario

Congreso; ALAG 2012; 2012

El riesgo de tromboembolismo venoso ha sido asociado a factores genéticos que incluyen las mutaciones FII G20210A y factor V Leiden G1691A. Dada la alta prevalencia (5?15% para G1691A y 2?4% for G20210A) en la población caucásica y el potencial para interactuar cooperativamente en el desarrollo de trombofilia existe una demanda creciente para la detección de ambas mutaciones puntuales en una misma muestra. Con el objetivo de implementar un diagnostico rápido y adecuado de las mutaciones FII G20210A y factor V Leiden G1691A se desarrolló una método de genotipificación simultánea en un solo tubo por PCR en tiempo real (LightCycler 2.0, ROCHE) en multiplex con sondas FRET y análisis de la curva de melting a dos longitudes de onda diferentes (640 y 705 nm, respectivamente). Para la validación del ensayo se procesaron simultaneamente 20 muestras de sangre periférica (15 wild type y 5 heterocigotas para la mutacion en FII; y 11 wild type, 8 heterocigotas, y 1 homocigota para la mutacion en factor V Leiden) por PCR en tiempo real y por la técnica convencional por RFLP obteniendose un 100% de concordancia en los resultados obtenidos por ambas técnicas. Mediante el análisis de las curvas de melting se pudieron indentificar los distintos alelos. Los picos de melting leídos a 640nm fueron 60,49ºC para el alelo wild type (0,24 DS; n = 35 alelos) y 53,49ºC (0,31 DS; n = 5 alelos) para la mutacion FII G20210A. El análisis a 705 nm reveló un pico a 57,07ºC (0,37 DS; n = 28 alelos) para el alelo wild type y un pico a 50,6ºC (0,25 DS; n = 10 alelos) para el alelo mutado factor V Leiden G1691A. De las ... muestras analizadas hasta el momento por PCR en tiempo real no se encontró ninguna muestras que diera resultados ambiguos. El ensayo desarrollado permite la determinación de las mutaciones FII G20210A y factor V Leiden G1691A de manera simple, rápida, confiable y rentable, minimizando el riesgo de contaminación post amplificación.