Efecto de la acidez del medio sobre la permeabilidad al agua en acuaporinas de tonoplasto

MOIRA SUTKA, KARINA ALLEVA, RICARDO DORR, MARIO PARISI Y GABRIELA AMODEO

Buenos Aires, Argentina

Congreso; XXVI Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Biofísica; 2002

SAB

La membrana plasmática y la membrana vacuolar (tonoplasto) de las células vegetales expresan abundantemente acuaporinas (denominadas PIPs y TIPs, respectivamente). La permeabilidad al agua (Pf) del tonoplasto se midió en diferentes especies y tejidos, habiendo una gran variabilidad en los valores presentados en la literatura. Esta variación puede explicarse si el transporte de agua por la membrana es controlado estrictamente. Al presente se ha descripto una importante regulación para tiempos cortos para los canales de agua, basada en dos mecanismos: 1) la fosforilación y defosforilación de la proteína o 2) la respuesta a variaciones en el pH.Nuestro laboratorio caracterizó el transporte de agua en vacuolas aisladas de células de la raíz almacenadora de la remolacha (Beta vulgaris), mediante un sistema que permite seguir los cambios de volumen usando videomicroscopía. Pudimos medir comportamientos osmóticos a tiempos largos (> 10 s), y los efectos al variar el pH extravacuolar. Claramente demostramos que la acidificación del medio externo inhibe el transporte de agua. Optimizando el sistema de medición para tiempos cortos (< 10 s) se calculó un Pf de 19.87 ± 2.21 mm s-1 (±SEM, n= 6), menor que el calculado con otra técnica por Morillon et al en la misma especie. A pesar de que no se debe descartar el efecto de las capas no mezcladas que pueden llevar a una subestimación de los valores de Pf, en este caso también se observó inhibición por pH ácido. Para estudiar la permeabilidad al agua independientemente del metabolismo celular de la célula vegetal se trabajó con dos sistemas diferentes: 1) cRNA de Beta vulgaris expresado en ovocitos de Xenopus laevis y 2) vesículas aisladas de tonoplasto de células de la raíz almacenadora de Beta vulgaris. En los experimentos realizados en ovocitos se inyectaron cRNA de pDCTIP3 y se hicieron mediciones de permeabilidad osmótica 72 h después de la inyección con el clon. Para evaluar el posible efecto del pH interno o externo sobre Pf se hicieron los experimentos incubando los ovocitos con NaAc o NaCl a pH=6. Los resultados obtenidos indican que no hay una reducción en los valores de Pf cuando el pH interno desciende, pero sí cuando los ovocitos se exponen a pH ácido externo, ya que se evidencia una reducción de aproximadamente 23%. Por otro lado, se obtuvieron vesículas de tonoplasto a partir de la centrifugación en gradiente de sacarosa (10%-23%) de microsomas de raíz. Estas vesículas presentaron muy baja contaminación con otras membranas. La permeabilidad osmótica de las vesículas de tonoplasto se analizó siguiendo cambios de volumen luego de aplicado un shock osmótico, mediante light scattering en un espectrofotómetro de stopped flow (90º, 500 nm). Así, se estudió el efecto de pH determinando Pf en dos condiciones: pH 8.3 y pH 5.6. Los resultados obtenidos muestran que a pH 5.6 la permeabilidad osmótica de las vesículas de tonoplasto se reduce un 25%. De esta manera, los resultados obtenidos tanto en ovocitos que expresan acuaporina de tonoplasto como en vesículas aisladas de esta membrana, confirman la inhibición del transporte de agua que se observa cuando el medio externo de la preparación se acidifica. FONCYT PICT/99 5145 y Grant IFS C3052.