Acuaporinas activas en vesículas de membrana plasmática vegetal obtenidas sin protección contra defosforilación

KARINA ALLEVA, MOIRA SUTKA, RICARDO DORR, MARIO PARISI Y GABRIELA AMODEO

Buenos Aires, Argentina

Congreso; XXVI Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Biofísica; 2002

SAB

A pesar de la abundancia de acuaporinas en vesículas aisladas de membrana plasmática (VMPs) de plantas, las primeras mediciones de permeabilidad al agua (Pf) realizadas en diferentes laboratorios dieron valores bajos, asociados con una alta energía de activación (lo que supone canales de agua inactivos) (1, 2). Gerbeau et al (3) desarrollaron un procedimiento de purificación de VMPs donde utilizaron un cocktail con inhibidores de fosfatasas y quelantes de cationes divalentes. Bajo estas condiciones se obtuvieron vesículas con Pf aumentado (canales de agua activos). En nuestro laboratorio se probaron dos protocolos para aislar VMPs de la raíz almacenadora de remolacha (Beta vulgaris): uno en el que se evitaron los efectos de iones divalentes y se aumentó la protección contra fosfatasas y otro standard sin proteción. La técnica emplea un sistema de partición acuoso de dos fases. Para la verificación del producto obtenido se realizaron ensayos con marcadores enzimáticos. El aislamiento da como resultado la obtención de vesículas con muy baja contaminación con otras membranas celulares. El factor de enriquecimiento obtenido fue de 4. Las vesículas obtenidas presentan un diámetro de 153±15 nm (±SEM, n=9), medido mediante dynamic light scattering. También se calculó el porcentaje de vesículas con orientación “right side-out” (orientadas con la cara citoplasmática hacia el interior de la vesícula) siguiendo la latencia de la ATPasa inhibida por vanadato en presencia de 0.05% Brij, dando como resultado que el 75% de ellas está orientado de esta manera. Para la medición de transporte de agua a través de la membrana vesicular se indujo una apertura transiente de las vesículas mediante un shock hiposmótico, de forma tal que el interior de éstas alcanzara la misma composición que la solución extravesicular. Luego se mezcló un volumen de solución conteniendo VMPs equilibradas con un volumen igual de la solución presente en el interior vesicular pero con manitol 500 mM. Los cambios de volumen y la permeabilidad de VMPs se siguieron con light scattering (90º, 500 nm) en un espectrofotómetro de stopped-flow. El valor de Pf obtenido en condiciones standard (261±42 mm s-1 (±SEM, n=7)), no es significativamente diferente del de las VMPs obtenidas sin protección (217±30 mm s-1 (±SEM, n=3)). El coeficiente de permeabilidad calculado fue alto en comparación con valores publicados para otros vegetales (4, 5). Nuestros resultados muestran que, en el caso de las raíces de Beta vulgaris, no es necesaria la protección contra una posible desfosforilación de los canales de agua durante la purificación de vesículas de membrana plasmática para mantenerlos activos. Este trabajo refuerza el concepto de que no todas las acuaporinas de membrana plasmática de células vegetales se regulan de igual manera. 1. Maurel C, et al. 1997b Prod. Nat. Acad. Sci. USA. 94:7103-7108. 2. Niemietz, CM and Tyerman, S 1997 Plant Physiol. 115:561-567. 3. Gerbeau P et al, 1999 Plant J. 18:577-587. 4. Gerbeau P, et al. 2002 The Plant J. 30(1):71-81. 5. Dordas C, et al. 2000 Plant Physiol. 124:1349-1361 Proyecto apoyado por FONCYT PICT/99 5145 y Grant IFS C3052.