Estudio de las propiedades de la membrana plasmática de células del parénquima de raíz de remolacha (Beta vulgaris).

KARINA ALLEVA, MOIRA SUTKA, RICARDO DORR, MARIO PARISI Y GABRIELA AMODEO

Tafí del Valle, Tucumán

Congreso; XXV Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Biofísica; 2001

SAB

Las membranas vegetales que délimitan tanto a la vacuola como a la célula estan energizadas por bombas de protones y son responsables del transporte de minérales, metabolitos y agua, esenciales para el mantenimiento de la turgencia celular y procesos de osmoregulaciôn. Para poder caracterizar los mécanismos involucrados en el transporte de agua y solutos a través de la membrana plasmatica y entender su regulaciôn, utilizamos como material de estudio el parénquima de la raíz de remolacha (Beta vulgaris L.) obteniendo a partir del mismo dos preparaciones que se complementan: 1) a nivel célula entera, el protoplasto, un sistema de multicompartimientos, donde la actividad metabôlica no esté disociada y 2) a nivel subcelular, a través de vesiculas purificadas de membrana plasmatica, desprovistas de la batería del metabolismo celular. Estudios a nivel célula entera (protoplastos): se utilizó una técnica de digestion enzimatica y centrifugación para obtener una préparation limpia de protoplastos adaptando un protocolo de Schmidt y Poole [Plant Physiol. (1980) 66:25-28]. Resultados: se obtuvieron preparaciones con un rendimiento de 3.10 106 protoplastos.ml'1 y con diametro promedio 32.21±0.62 µm (±SEM, n=174) para un medio iso-osmôtico (530 mOsm.kg" ). Utilizando un método por videomicroscopia que permite medir cambios volumétricos en células en segundos, y reduciendo el intervalo de medición de un mismo protoplasto entre el control (iso-osmôtico) y un gradiente osmôtico se realizaron estimaciones de la permeabilidad al agua. El cambio de volumen relativo (V/V0) a los 20s de haber impuesto un gradiente hipo-osmôtico de 200 mOsm.kg'1 fue del 15% ± 1 (± SEM, n=7 aislamientos independientes, 4 a 7 protoplastos por aislamiento). Se estimaron ademas los valores de permeabilidad considerando el efecto de capas no mezcladas [Parisi y Piccinni, 1973, J. Memb. Biol. 12:227-234]. Estudios a nivel subcelular. Para poder contar con una preparación que sea representativa de la membrana en su condition nativa y que esté libre de membranas contaminantes nuestro objetivo se concentró en esta primera etapa en obtener vesiculas de membrana plasmatica purificadas. Resultados: En primer lugar se obtuvo una fracción microsomal cruda (0.60±0.15mg proteina.g''tejido fresco, ± SEM, n -6 aislamientos independientes). Para purificar la fracción correspondiente al plasmalema se utilizó la partición de dos fases (Dextran-Polietilenglicol), que es mas efectivo para células vegetales que el método de gradiente de sacarosa [Packer y Douce, 1987, Meth in Enzym. 148:559-568]. Durante la purificaciôn se realiza una partición diferencial, obteniéndose en la fase superior del sistema membranas plasmaticas y el resto de las membranas (mitocondriales, cloroplasticas, etc.) en la fase inferior. Se obtuvieron asi dos muestras de membrana plasmatica (PM1 y PM2), siendo PM1 la primer fâse superior separada y PM2 el producto de una segunda partición realizada sobre la primer fase inferior obtenida. Para controlar la pureza de las fracciones PM1 y PM2 se determinaron actividades de enzimas marcadoras de membranas y se compararon con las présentes en la fracciôn microsomal cruda. El factor de enriquecimiento logrado en la fracción PM1 con respecto a la fracción microsomal estaba comprendido entre 4 y 5, mientras que para PM2 entre 2 y 3. Ëstos valores son acordes con los informados en la literatura clâsica para otras preparaciones [en tabaco, Maurel et al., 1997, PNAS 94:7103-7108 y en tomate Grimes y Breidenbach, 1987, Plant Physiol. 85:1048-1054]. Los valores de las actividades de enzimas marcadoras de membranas de mitocondria (0.55±0.55 p.moles.min'l.mg1"proteina, n=5), reticulo endoplasmatico (0.28±0.09 Hmoles.min"'.mg"1 proteina, n=6 ) y tonoplasto (1.29±0.63 firnoles Pi.h"'mg'' proteina, n=7), indican que la contaminaciôn por parte de estas en las fracciones purificadas es muy baja. Conclusiones: En protoplastos aislados estimamos la permeabilidad al agua de la preparacion bajo estudio. Se optimizô ademas una técnica de aislamiento de vesiculas de membrana plasmatica, altamente purificada que permitirâ realizar estudios de transporte de agua y solutos a través de la manipulaciôn compléta de las concentraciones a ambos lados de la membrana (lado interno y externo) y la utilizaciôn de la escalas temporales râpidas de mediciôn a través de técnicas mas sofisticadas (stopped flow).