Caracterización de interrupciones y deleciones génicas del locus DHFR-TS en clones transfectantes de Trypanosoma cruzi

PÉREZ BRANDAN CM, XU D, PADILLA AM, TARLETON R, BASOMBRÍO MA

Chascomus, Buenos Aires, Argentina

Otro; XXII Reunión de la Sociedad Argentina de Protozoologia; 2007

Sociedad Argentina de Protozoología

Nuestro principal objetivo es desarrollar una mutante auxotrofica nula para el gen dhfr-ts en Trypanosoma cruzi mediante deleción dirigida de genes. El gen dhfr-ts es metabólicamente esencial para el parásito y codifica para la enzima dihidrofolato reductasa – thimidina sintetasa (DHFR-TS) la cual es clave en el metabolismo de los folatos y en la producción de timidina. La inhibición de esta enzima previene la síntesis de timidina y por lo tanto la biosíntesis de ADN, resultando en la muerte celular. Utilizando las regiones flanqueantes y codificantes del gen dhfr-ts, generamos vectores de reemplazo para la deleción e interrupción del mismo respectivamente empleando los genes de resistencia a neomicina e higromicina. Los plásmidos fueron digeridos y los fragmentos de recombinación purificados y electroporados en la cepa virulenta Tulahuen y en la cepa atenuada TCC de T. cruzi. Se obtuvieron parásitos resistentes a neomicina, higromicina y a ambas drogas combinadas. Los resultados de PCR y Southern Blot de parásitos resistentes no clonados mostraron que los genes de resistencia a antibióticos se recombinaron en el locus correcto. Estos parásitos resistentes fueron clonados para obtener simples y dobles mutantes para el gen dhfr-ts en ambas cepas. Actualmente más de 20 clones de cada cepa están siendo caracterizados molecularmente. Estos parásitos modificados genéticamente serán evaluados en cuanto a su infectividad empleando modelos in vitro e in vivo. También se evaluará en un modelo murino la inmunogenicidad y la capacidad protectiva de los mismos contra un desafío virulento. La manipulación genética y la deleción de genes específicos de T. cruzi abren la posibilidad de generar vacunas experimentales que combinen la inmunogenicidad de las vacunas vivas y la seguridad que los parásitos naturalmente atenuados carecen. Proyecto financiado por CONICET, HHMI y FONCYT.