Generación de una mutante bigénica monoalélica de Trypanosoma cruzi para el estudio de la respuesta inmune y la persistencia de dichos parásitos en el hospedador mamífero

PEREZ BRANDAN C, SANCHEZ VALDEZ F, PADILLA AM, BASOMBRIO MA

Ascochinga, Cordoba

Otro; XXIV Annual Scientific Meeting, Argentinean Society of Protozoology; 2010

En nuestro laboratorio, el empleo como inmunógeno de parásitos vivos de una cepa naturalmente atenuada de Trypanosoma cruzi, denominada TCC, ha mostrado conferir una protección parcial contra posteriores infecciones virulentas. Sin embargo, los mecanismos naturales de atenuación de esta cepa no son conocidos. Con el objetivo de introducir un mecanismo de atenuación seguro generamos, mediante recombinación homóloga, una mutante monoalélica para el gen dihidrofolato reductasa–timidilato sintasa en la cepa TCC de T. cruzi (TCC dhfr-ts+/-). Vimos que esta mutante, induce una frecuencia menor de células T CD8+ especificas contra T. cruzi en animales infectados en comparación con parásitos wild type y que además, es capaz de proteger contra un posterior desafío virulento de igual manera que parásitos TCC wild type. Sin embargo, estos parásitos mutantes, todavía son capaces de infectar ratones inmunocompetentes y persistir en el hospedador. Con el objeto de buscar un mecanismo alterno que nos permita minimizar las posibilidades de que los parásitos “vacunantes” persistan en el hospedador y que a su vez sean capaces de generar una respuesta inmune adecuada nos propusimos introducir una nueva mutación en un gen distinto en la cepa TCC dhfr-ts+/-. El gen candidato fue el gen ptr1 que codifica para la enzima pteridina reductasa. En diferentes especies de Leishmania se ha visto que la enzima pteridina reductasa 1 (PTR1) es capaz de reducir el folato a dihidrofolato y luego tetrahidrofolato, previniendo de esta manera la muerte celular. Esta enzima es la responsable de rescatar estos parásitos de Leishmania carentes del gen dhfr-ts, permitiendo que los mismos persistan en el organismo hospedador. En base a esto, generamos vectores de reemplazo para el gen ptr1 de T. cruzi mediante el empleo del sistema Multisite Gateway. Parásitos TCC wild type como TCC dhfr-ts+/- fueron electroporados con los fragmentos de recombinación obtenidos a partir de los vectores de reemplazo y seleccionados en el antibiótico correspondiente. Actualmente estos parásitos transfectados están siendo clonados y caracterizados molecularmente para su posterior evaluación en modelos animales. Este trabajo es financiado por CONICET y PICT.