Mutagénesis dirigida al gen de la dihidrofolato reductasa - timidilato sintetasa (dhfr-ts) de Trypanosoma cruzi

PÉREZ BRANDAN C, CIACCIO M, PADILLA AM, BASOMBRÍO MA

Mendoza, Argentina

Congreso; VII Congreso Argentino de Protozoología y Enfermedades Parasitarias; 2005

Sociedad Argentina de Protozoología

El objetivo principal de este trabajo es evaluar la capacidad de una mutante nula para dhfr-ts de Trypanosoma cruzi para infectar ratones y luego protegerlos contra un desafío virulento. Decidimos trabajar con el gen dhfr-ts porque es un gen de copia simple que codifica para la proteína dihidrofolato reductasa- timidilato sintetasa (DHFR-TS). Esta enzima es fundamental en el metabolismo intermediario de nucleótidos pirimidínicos y ácidos nucleicos, catalizando secuencialmente reacciones en la síntesis de novo de la timidina 5´monofosfato (dTMP). El bloqueo de la actividad DHFR-TS da lugar a una disminucion de dTMP en la célula y muerte celular por falta de timidina. Las secuencias completas del gen dhfr-ts que codifica para dicha proteína fue obtenida por Ciaccio para la cepa virulenta Tulahuen y la cepa atenuada TCC (AF494019 y AF494020). Los resultados de alineamiento mostraron una homología mayor al 98%. Usando primers específicos, pudimos obtener por PCR la secuencia codifcante de este gen e insertarla en el plásmido pBlueScript e interrumpirla con genes de resistencia a antibióticos. De este modo se obtuvieron los plásmidos de sustitución usados en los ensayos de electroporación. Tanto las cepas TCC y TUL fueron transfectadas con estos plásmidos y seleccionadas en los antibióticos correspondientes. Mediante PCR confirmamos la interrupción de ambos alelos de este gen de copia simple. Actualmente estamos clonando estas líneas resistentes a antibióticos para posteriores ensayos de Southern Blot y pruebas de auxotrofismo. Una vez obtenidos los clones modificados geneticamente vamos a usarlos ocmo inmunógenos vivos en ratones, probando su capacidad de proteger contra un posterior desafío virulento con T. cruzi.