MÉTODO DE FLUORESCENCIA APLICADO AL SCREENING DE DROGAS CON ACTIVIDAD LEISHMANICIDAS

PAOLA A BARROSO, CECILIA PERÉZ BRANDÁN, SABRINA PORTELLI, CARLOS HOYOS, FERNANDA GARCÍA BUSTOS, ESTEFANÍA BRACAMONTE, MIGUEL A BASOMBRÍO, JORGE D MARCO; CECILIA PEREZ BRANDAN; SABRINA PORTELLI; CARLOS HOYOS; FERNANDA GARCIA BUSTOS; ESTEFANIA BRACAMONTE; MIGUEL ANGEL BASOMBRIO; DIEGO MARCO

Congreso; X Congreso de Protozoologia y Enfermedades Parasitarias; 2014

El método convencional para la evaluación de actividad leishmanicida de drogas noveles, se basa en el conteo de parásitos al microscopio óptico. Esta técnica resulta laboriosa en el caso de screening de compuestos. El objetivo de este trabajo fue normatizar un método para determinar la viabilidad de parásitos a través de la expresión de una proteína fluorescente. El gen tdtomato, que codifica para una proteína fluorescente, se subclonó en el plásmido pIR1SAT. Se electroporó una cepa de Leishmania (Leishmania) amazonensis (MHOM/BR/73/M2269) con 10 μg del plásmido linealizado. Los parásitos se seleccionaron con nourseotricina y se clonaron. La expresión de fluorescencia (FL) del clon M2269/tc3, se determinó en promastigotes (PM) y en amastigotes (AM) aislados de macrófagos (MC). Parásitos de M2269/tc3 se diluyeron desde 3x10e8 PM/ml y desde 3x10e7 AM/ml y la FL fue medida en un lector de placas. La eficacia de la miltefosina (MI) fue evaluada empleando el modelo de PM y MC-AM. Para ello, 1x10e7 PM/ml de M2269/tc3 se plaquearon con diferentes concentraciones de MI. En el modelo MC-AM, células J774.1 se infectaron en un radio de 10 PM y se incubaron con diferentes concentraciones de MI. La viabilidad M2269/tc3 se determinó midiendo la FL. Para M2269/WT, la viabilidad se determinó contando el número de PM vivos y calculando el porcentaje de infección en MC-AM. La concentración inhibitoria 50 (CI50) en ambos sistemas se calculó mediante el análisis de regresión no lineal. La expresión de FL de PM y AM fue proporcional al número de parásitos (r2 = 0,98). Los valores de CI50 de MI determinados por el método de FL (PM 5,3 μg/ml, AM 9,3 μg/ml) fueron similares a los obtenidos mediante los métodos convencionales (PM 5,2 μg/ml, AM 3,5 μg/ml). Concluimos que la expresión de FL es un buen indicador de la viabilidad de los parásitos transfectados, útil para el análisis de drogas leishmanicidas de manera simple y rápida en un modelo in vitro de Leishmania (L.) amazonensis.