Inducción de hipersensibilidad a NFX y BZN en cepas resistentes de Trypanosoma cruzi mediante sobreexpresión de la enzima Nitroreductasa Tipo I

FERNANDO SÁNCHEZ; CAROLINA DAVIES; CECILIA PÉREZ BRANDAN; MIGUEL ANGEL BASOMBRIO

Ascochinga, Cordoba

Otro; XXIV Annual Scientific Meeting, Argentinean Society of Protozoology; 2010

Nifurtimox y Benznidazol constituyen drogas de primera línea utilizadas para el tratamiento de la enfermedad de Chagas. Actúan como prodrogas y deben ser activadas en el parásito para mediar efectos tripanocidas. La enzima nitroreductasa de tipo I (NTR), caracterizada originalmente en bacterias, es responsable de activar ambas drogas generando el radical libre nitroanión. Ensayos de deleción génica dirigida y resistencia inducida a drogas en Trypanosoma cruzi demostraron que la perdida de una sola copia de TcNTR es suficiente para provocar resistencia a una amplia variedad de compuestos nitroheterocíclicos. De forma contraria, se podría asumir que la sobreexpresión del gen TcNTR generaría parásitos aún más susceptibles a la acción de estas drogas. En el presente trabajo nos proponemos obtener más información acerca de la enzima TcNTR y su rol en la resistencia natural a drogas que posee la cepa Colombiana de T. cruzi. Se pretende determinar si la resistencia observada en esta cepa se encuentra relacionada, al menos en parte, con una baja expresión de la enzima TcNTR. La secuencia codificante de 939pb de TcNTR se amplificó mediante PCR a partir de ADN genómico de epimastigotes de T. cruzi, la cual fue luego clonada en el plásmido de expresión de T.cruzi pTREX. La construcción generada (pTREX-TcNTR) fue posteriormente caracterizada mediante ensayos de restricción, PCR y secuenciación. Luego, dicha construcción fue utilizada para transfectar diferentes cepas de epimastigotes de T. cruzi. Los cultivos fueron seleccionados con 200 ug/ml de G418. Tras aproximadamente 4 semanas de selección recuperamos parásitos resistentes de una cepa naturalmente atenuada de T. cruzi, denominada TCC y de la cepa Colombiana. Utilizando DNA genómico de estas cepas se caracterizó y se confirmó mediante PCR la integración de la construcción transfectada en el genoma del parásito. Los próximos pasos consisten en realizar ensayos de actividad enzimática y Western blot para confirmar la sobreexpresión de TcNTR en estas cepas. Posteriormente se evaluará la resistencia o susceptibilidad de estas cepas sobre-expresando NTR a BZL y NFX. Este trabajo es financiado por CONICET y FONCYT.