Generación de una mutante bigénica monoalélica de Trypanosoma cruzi para el estudio de la respuesta inmune y la persistencia de dichos parásitos en el hospedador mamífero

CECILIA PÉREZ BRANDAN; FERNANDO SÁNCHEZ VALDEZ; ÁNGEL M. PADILLA; MIGUEL ÁNGEL BASOMBRÍO

Ascochinga, Cordoba

Otro; XXIV Annual Scientific Meeting, Argentinean Society of Protozoology; 2010

Sociedad Argentina de Protozoologia

La preinoculación, en modelos animales, de parásitos atenuados de T. cruzi, es protectora contra cepas virulentas; sin embargo, los mecanismos de atenuación de los mismos no son conocidos. Con el objeto de introducir mecanismos conocidos de atenuación de la virulencia, hemos ensayado, en estudios previos, mutantes monogénicas bialélicas de T. cruzi y mutantes monogénicas monoalélicas. En el presente trabajo informamos los avances en los intentos de obtener una mutante bigénica, monoalélica, introduciendo una segunda deleción de un alelo del gen ptr1 sobre una línea previamente mutada y caracterizada, denominada TCC dhfr-ts+/-. El gen ptr1 codifica para la enzima pteridina reductasa y se ha visto que en parásitos auxotróficos de Leishmania, nulos para el gen dhfr-ts, esta enzima (PTR1) es capaz de reducir el folato a dihidrofolato y luego a tetrahidrofolato, previniendo de esta manera la muerte celular de estos parásitos. La doble deleción, dhfr-ts + ptr1, podría privar a T. cruzi, mantenido en medios auxotróficos, de un camino enzimático esencial para su persistencia en huéspedes infectados. Con el objeto de delecionar al menos un alelo del gen ptr1, generamos vectores de reemplazo para el mismo mediante el empleo del sistema Multisite Gateway (Invitrogen). A partir de los vectores de reemplazo purificamos los fragmentos de recombinación los cuales fueron electroporados en epimastigotes de la cepa TCC wild type y epimastigotes TCC dhfr-ts+/-. Estos parásitos fueron seleccionados en el antibiótico correspondiente y clonados mediante el método de las diluciones sucesivas. Caracterizaciones moleculares preliminares mediante PCR indicarían la obtención de una población mutante bigénica monoalélica de Trypanosoma cruzi; sin embargo, estudios moleculares mas profundos, como Southern Blot, son necesarios para corroborar esta observación. Se plantea como pasos futuros evaluar el comportamiento de estas mutantes para dos genes en modelos animales. Este trabajo es financiado por CONICET y ANPCYT.