Caracteristicas fenotipicas producto de la delecion dirigida de un alelo del gen Calreticulina en Trypanosoma cruzi

FERNANDO J. SANCHEZ VALDEZ; CECILIA PEREZ BRANDAN; PAOLA ZAGO; MIGUEL ANGEL BASOMBRIO

Mar del Plata

Congreso; IX Congreso de Protozoologia y Enfermedades Parasitarias; 2011

Sociedad Argentina de Protozoologia

En Trypanosoma cruzi, Calreticulina (TcCRT) es una chaperona de union a calcio localizada principalmente en Reticulo Endoplasmico y translocada al sitio de la membrana plasmatica de emergencia del flagelo. Ensayos in vitro demostraron que TcCRT une las porciones colagenas de la molecula de reconocimiento del sistema del Complemento vertebrado C1q. Esta union resulta en la inhibicion de la formacion de C3/C5 convertasa y el complejo de ataque a la membrana, de esta forma TcCRT impide la activacion de la via clasica del Complemento. Ademas, TcCRT constituye un factor de virulencia de T. cruzi ya que la propia mol¨¦cula y los anticuerpos anti-TcCRT generados producen un deposito de moleculas C1q en la membrana del paparasito que promueven la quimiotaxis de macrofagos y favorecen la invasion y la infectividad del parasito. Con el objeto de determinar la importancia de TcCRT en el desarrollo y establecimiento de la infeccion in vivo generamos una mutante monoalelica crt/CRT en la cepa naturalmente atenuada TCC de T. cruzi mediante recombinacion homologa. Por otra parte, generamos parasitos de la cepa TCC sobreexpresando el gen TcCRT mediante transfeccion con el plasmido pTrex-CRT. Estudios in vitro mostraron que la mutaci¨®n inducida no altero la morfologia de los parasitos, sin embargo, epimastigotes mutantes presentan una disminucion significativa en la tasa de crecimiento en cultivos axenicos (p=0.0448) y en la capacidad de metaciclogenesis con respecto a la cepa parental TCC wild type (p=0.0379). Por otro lado, ensayos de lisis mediada por Complemento utilizando suero humano normal fresco, revelaron que epimastigotes TCC crt/CRT poseen una susceptibilidad significativamente mayor a la accion litica del Complemento (p= 0.0273) en comparacion con epimastigotes TCC wild type, dicha suceptibilidad se verifica a partir de 20% de suero y 10 min. de incubacion, De forma contraria, parasitos TCC sobre-expresando TcCRT demostraron ser resistentes a la lisis por Complemento con respecto a su contraparte wild type (p= 0.0180). En ensayos de virulencia in vivo observamos mediante PCR y hemocultivos que ratones nude y Balb/c infectados con la mutante crt/CRT presentan una disminucion de la presencia de T. cruzi en la etapa cronica de la infeccion. De la misma manera, mediante ELISA detectamos una reduccion de la produccion de anticuerpos en esta etapa de la enfermedad. Proximamente examinaremos la inmunoprotecion conferida por parasitos mutantes en animales de experimentacion y realizaremos ensayos de metaciclogenesis in vivo en vinchucas alimentadas artificialmente con el objeto de verificar el comportamiento observado in vitro. Asi tambie¦n caracterizaremos la infectividad y la replicacion intracelular del mutante en ce¦lulas VERO.