Evaluación de alfa hemolisina como blanco terapéutico para tratar infecciones urinarias mediadas por Escherichia coli en embarazadas

MELISA PUCCI MOLINERIS; MARÍA SILVIA LIMA; PABLO PELINSKI; FLORENCIA SCHIBERT; MARIANA FARINA; VANESA HERLAX

Congreso; XL Congreso de Obstetricia y Ginecología. SOGIBA 2023.; 2023

Introducción: El rápido surgimiento de cepas bacterianas resistentes a antimicrobianos debido al mal uso y abuso de antibióticos de los últimos años llevó al desarrollo de las terapias anti-virulencia. Éstas proponen neutralizar los efectos que los factores de virulencia de los patógenos producen. De esta manera se lograría controlar al patógeno sin ejercer presión selectiva sobre las bacterias y así limitar el surgimiento de cepas resistentes.Las infecciones del tracto urinario (ITU) son las patologías infecciosas más frecuentes en embarazadas y pueden producir efectos adversos tanto en la madre como en el bebé e incluso causar ruptura prematura de membranas fetales y partos prematuros o abortos. Las cepas uropatogénicas de Escherichia coli (UPEC) son responsables del 80% de los casos y un 50% de ellas presenta resistencia a al menos un antibiótico. Uno de los factores de virulencia más importantes de estas cepas es la alfa-hemolisina (HlyA), una exotoxina lítica que ha sido relacionada con complicaciones asociadas a las ITUs.Objetivos: Estudiar los efectos de HlyA, como factor de virulencia de las UPEC, sobre las membranas fetales e investigar la capacidad protectora de anticuerpos anti-HlyA en un modelo de UTI ascendente in-vitro.Metodología: Se obtuvieron membranas corioamnióticas (n=13) de partos por cesárea electiva (>37 semanas). Todas las mujeres incluidas tuvieron embarazos normales sin evidencia de trabajo de parto activo o infección. Se montaron y aseguraron explantos (secciones circulares) de membrana en un dispositivo Transwell, generando dos cámaras independientes. Para simular una infección ascendente, los explantos se incubaron desde el lado del corion con 5nM y 50nM de HlyA durante 24 horas. HlyA fue detectada mediante inmunohistoquímica y, posteriormente, se evaluaron signos histológicos de daño (como edema, vacuolización y apoptosis) a partir de secciones de tejido incluidas en parafina y teñidas con hematoxilina/eosina. Se midió la resistencia eléctrica transepitelial (RETE) utilizando una unidad Millicell-ERS y necrosis mediante la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH). Además, se evaluó actividad de metaloproteasas (MMP) mediante zimografía y la expresión de la ciclooxigenasa-2 (Cox2) por RT-qPCR. Por otra parte, para evaluar el rol protector de anticuerpos anti-HlyA, se realizó otra serie de experimentos en dónde se estimuló, desde el corion, a las membranas (n=4) con HlyA 50nM previamente incubada con diferentes diluciones (1:100, 1:50 y 1:25) de anticuerpos policlonales anti-HlyA durante 10min. Se midieron liberación de LDH y la actividad MMP tras 24h de incubación. Un control con el título más alto de anticuerpos anti-HlyA (sin toxina) fue incluido.Los grupos se compararon mediante test de T de una muestra, ANOVA o test de T apareado según correspondiera y los valores se muestran como media ± SEM. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el software GraphPad Prism 8.02. Resultados: HlyA interaccionó indistintamente con ambos lados de la membrana corioamniótica, y fue capaz también de adherirse y penetrar en varias líneas de células del trofoblasto. Confirmada esta interacción, membranas fetales que fueron incubadas sólo desde el corion (modelo ITU ascendente) evidenciaron alteraciones estructurales y una disminución de la RETE al contacto con la toxina. Tras 24hs, la RETE recupera un valor similar al grupo control en membranas tratadas con HlyA 5nM mientras que, en las tratadas con HlyA 50nM, la disminución es irreversible en los tiempos ensayados. Las mayores alteraciones tisulares se observaron para la mayor concentración de toxina probada (HlyA 50nM). La capa epitelial permaneció prácticamente inalterada, mientras que las células del corion mostraron un incremento de vacuolización y necrosis. El espesor de la matriz extracelular y la desorganización de las fibras de colágeno fue mayor en los grupos tratados en comparación con el control. Consistentemente, la expresión de COX-2 y actividad de MMPs se vieron elevadas por el tratamiento con la toxina. Al preincubar la toxina con anticuerpos, las membranas presentaron viabilidad y actividad MMP similar al control.Conclusión: HlyA es, por sí misma, capaz de introducir cambios moleculares compatibles con el remodelado de la matriz extracelular de membranas fetales, sugiriendo un rol de la toxina en la ruptura prematura de las mismas. El tratamiento con anticuerpos anti-HlyA disminuye los efectos deletéreos ocasionados por la HlyA in-vitro. Todo lo expuesto, convierte a HlyA en un posible blanco para el desarrollo de terapias anti-virulencia para el tratamiento de ITUs en mujeres embarazadas.