Fitorremediación de 2,4-diclorofenol por raíces transformadas de nabo: escalado del proceso y caracterización de enzimas involucradas

VÍCTOR BUSTO; VANINA ANGELINI; JOAQUÍN OREJAS; HORACIO TIGIER; SILVIA MILRAD; ELIZABETH AGOSTINI

Ciudad de Buenos Aires

Congreso; BAIRESBIOTEC 2005 Congreso Internacional – Grupo Biotecnología – VI Simposio Nacional Biotecnología – REDBIO Argentina 2005 – Encuentro Trinacional REDBIO Argentina-Chile-Uruguay; 2005

REDBIO Argentina - Grupo Biotecnología

Introducción Entre los compuestos de mayor toxicidad presentes en efluentes de diversas industrias, se encuentran el fenol y sus derivados, como 2,4-diclorofenol (2,4-DCF), cuya eliminación completa es necesaria ya que  provocan alteraciones en la salud humana y en la vida silvestre. La fitorremediación es una de las técnicas más recientemente aplicadas a decontaminación de efluentes industriales. En estudios previos la hemos aplicado utilizando cultivos de raíces transformadas de nabo (Brassica napus) para la remoción de 2,4-DCF y demostrado que se trataría de una metodología alternativa, de bajo costo y alta eficiencia, que opera en un amplio rango de pH y corto tiempo (Agostini et al., 2003). Además se estableció que las principales enzimas involucradas en dicho proceso serían peroxidasas, óxido-reductasas que pueden catalizar la transformación de numerosos compuestos orgánicos. Se observó también, que luego de varios ciclos de tratamiento del contaminante los perfiles de distribución de diversas isoenzimas de peroxidasa (IsoPx) mostraban cambios cuali y cuantitativos, sugiriendo que cada una de ellas contribuye de forma diferencial en la remoción del 2,4-DCF. Tanto las raíces transformadas de nabo como las IsoPx derivadas de las mismas, podrían tener aplicación industrial. Es por ello que el objetivo de este trabajo consistió en tratar de escalar el proceso previamente estudiado en el laboratorio mediante la aplicación de inóculos de raíces en un biorreactor de tanque agitado, además de identificar y caracterizar las IsoPx de estos cultivos involucradas en el proceso de transformación de 2,4- DCF. Materiales y métodos Material biológico: cultivos de raíces trans-formadas de nabo (Brassica napus) obtenidas según lo descripto por Agostini et al., 1997. Obtención de extractos crudos totales de peroxidasas: por homogeneización de raíces transformadas de nabo con tampón de pH 4 conteniendo 1 M de NaCl. Purificación de isoperoxidasas: a partir de los extractos crudos totales por cromatografía de intercambio iónico en columnas de DEAE-Sephacel. Determinación de actividad peroxidasa: cualitativa: con reactivo de bencidina y cuantitativa: por espectrofotometría con o-dianisidina (Agostini et al., 1997). Electroforesis e isoelectroenfoque: en geles de poliacrilamida teñidos con reactivo de bencidina. Ensayos de remoción de 2,4-DCF con enzimas: utilizando 200 UI/ml de IsoPx, 6 ml de 2,4-DCF 10 mg/l y H2O2 1mM. Determinación de 2,4-DCF: empleando el método de Klibanov et al., 1980. Determinación de parámetros cinéticos de isoperoxidasas: mediante el método espectro-fotométrico usando 2,4-DCF, H2O2 y 4-aminoantipirina (Nicell y Wright, 1997). Ensayos en el biorreactor: utilizando un biorreactor de tanque agitado (capacidad 3 l) con sensor de pH y temperatura, y sistema de circulación de agua a temperatura constante. Resultados y discusión a) Escalado del proceso En base a los resultados previos se presumiría que las raíces transformadas podrían ser utilizadas a mayor escala como fuente de peroxidasas. Estas raíces serían consideradas como un "tejido inmovilizador de enzimas" que les proporciona protección y estabilidad. Por ello se intentó llevar a cabo el proceso de escalado, manteniendo constantes las condiciones establecidas como óptimas a escala laboratorio (Agostini et al., 2003). Se determinó que un inóculo inicial de 10 g de raíces/l permitía al sistema conservar elevada eficiencia de remoción de 2,4-DCF. El ensayo de remoción se realizó durante un período de 5 hs. A los 30 min de incubación se logró la mayor eficiencia de remoción, que se mantuvo a lo largo de toda la experiencia (Figura 1). La re-utilización de la biomasa radical es una característica importante en su aplicación en fitorremediación a gran escala. Por lo tanto se realizaron ensayos durante cuatro ciclos consecutivos de incubación, de 30 min cada uno. Luego de cada ciclo se renovó la solución de 2,4-DCF, se agregó H2O2 5 mM y se determinó el 2,4-DCF residual logrando una eficiencia de remoción entre el 93-99% durante  los cuatro ciclos (Figura 2). b) Caracterización de las enzimas involucradas A partir de extractos crudos se logró purificar: a) un grupo de peroxidasas constituída por dos isoformas básicas (de pI alrededor de 9,6) y una neutra (de pI 6,5) mayoritarias (C+N) y b) una IsoPx acídica mayoritaria (A) de pI 3,8. Las IsoPx estudiadas mostraron elevada eficiencia de remoción de 2,4-DCF que fue mayor para la fracción de isoenzimas C+N en comparación con la isoenzima A,  ensayadas a igual actividad (Tabla 1). Se detectó pérdida de la actividad enzimática post-remoción de la fracción más eficiente (C+N), indicando que este grupo de peroxidasas sería muy sensible a la inactivación durante el tratamiento. Sin embargo, la isoperoxidasa A mantuvo su actividad casi intacta post-remoción (Tabla 1). Se observó una eficiencia  catalítica 6 veces mayor para la fracción C+N frente al valor obtenido para la isoenzima A, a pesar de poseer esta última un valor de Km mucho menor (Tabla 2). Los resultados de estos estudios cinéticos y de remoción de las isoperoxidasas purificadas a partir de raíces transformadas de nabo sugieren que por su estabilidad la isoforma A podría ser aplicada en sistemas contínuos de remoción. Conclusiones Las raíces transformadas de Brassica napus serían un sistema eficiente para la remoción de 2,4-DCF a escala reactor, de bajo costo y fácil aplicación. La re-utilización de biomasa radical representaría otra ventaja que demuestra el potencial de esta tecnología. Las IsoPx contenidas en las raíces demostraron una alta eficiencia de remoción de 2,4-DCF pero diferente sensibilidad a la inactivación. La IsoPx acídica, por su estabilidad sería la responsable de la remoción durante el reciclado de biomasa y podría ser utilizada en sistemas contínuos de remoción de 2,4-DCF ya que el % de eliminación del contaminante no cambia significativamente después de varios ciclos. b) Caracterización de las enzimas involucradas A partir de extractos crudos se logró purificar: a) un grupo de peroxidasas constituída por dos isoformas básicas (de pI alrededor de 9,6) y una neutra (de pI 6,5) mayoritarias (C+N) y b) una IsoPx acídica mayoritaria (A) de pI 3,8. Las IsoPx estudiadas mostraron elevada eficiencia de remoción de 2,4-DCF que fue mayor para la fracción de isoenzimas C+N en comparación con la isoenzima A,  ensayadas a igual actividad (Tabla 1). Se detectó pérdida de la actividad enzimática post-remoción de la fracción más eficiente (C+N), indicando que este grupo de peroxidasas sería muy sensible a la inactivación durante el tratamiento. Sin embargo, la isoperoxidasa A mantuvo su actividad casi intacta post-remoción (Tabla 1). Se observó una eficiencia  catalítica 6 veces mayor para la fracción C+N frente al valor obtenido para la isoenzima A, a pesar de poseer esta última un valor de Km mucho menor (Tabla 2). Los resultados de estos estudios cinéticos y de remoción de las isoperoxidasas purificadas a partir de raíces transformadas de nabo sugieren que por su estabilidad la isoforma A podría ser aplicada en sistemas contínuos de remoción. Conclusiones Las raíces transformadas de Brassica napus serían un sistema eficiente para la remoción de 2,4-DCF a escala reactor, de bajo costo y fácil aplicación. La re-utilización de biomasa radical representaría otra ventaja que demuestra el potencial de esta tecnología. Las IsoPx contenidas en las raíces demostraron una alta eficiencia de remoción de 2,4-DCF pero diferente sensibilidad a la inactivación. La IsoPx acídica, por su estabilidad sería la responsable de la remoción durante el reciclado de biomasa y podría ser utilizada en sistemas contínuos de remoción de 2,4-DCF ya que el % de eliminación del contaminante no cambia significativamente después de varios ciclos. b) Caracterización de las enzimas involucradas A partir de extractos crudos se logró purificar: a) un grupo de peroxidasas constituída por dos isoformas básicas (de pI alrededor de 9,6) y una neutra (de pI 6,5) mayoritarias (C+N) y b) una IsoPx acídica mayoritaria (A) de pI 3,8. Las IsoPx estudiadas mostraron elevada eficiencia de remoción de 2,4-DCF que fue mayor para la fracción de isoenzimas C+N en comparación con la isoenzima A,  ensayadas a igual actividad (Tabla 1). Se detectó pérdida de la actividad enzimática post-remoción de la fracción más eficiente (C+N), indicando que este grupo de peroxidasas sería muy sensible a la inactivación durante el tratamiento. Sin embargo, la isoperoxidasa A mantuvo su actividad casi intacta post-remoción (Tabla 1). Se observó una eficiencia  catalítica 6 veces mayor para la fracción C+N frente al valor obtenido para la isoenzima A, a pesar de poseer esta última un valor de Km mucho menor (Tabla 2). Los resultados de estos estudios cinéticos y de remoción de las isoperoxidasas purificadas a partir de raíces transformadas de nabo sugieren que por su estabilidad la isoforma A podría ser aplicada en sistemas contínuos de remoción. Conclusiones Las raíces transformadas de Brassica napus serían un sistema eficiente para la remoción de 2,4-DCF a escala reactor, de bajo costo y fácil aplicación. La re-utilización de biomasa radical representaría otra ventaja que demuestra el potencial de esta tecnología. Las IsoPx contenidas en las raíces demostraron una alta eficiencia de remoción de 2,4-DCF pero diferente sensibilidad a la inactivación. La IsoPx acídica, por su estabilidad sería la responsable de la remoción durante el reciclado de biomasa y podría ser utilizada en sistemas contínuos de remoción de 2,4-DCF ya que el % de eliminación del contaminante no cambia significativamente después de varios ciclos.