Caracterizacion estructural del desplegamiento de una proteína term¨®fila de membrana

ERNESTO A. ROMAN; JOSÉ MARTÍN ARGUELLO; FRANCISCO LUIS GONZALEZ FLECHA

Universidad Nacional de Quilmes, Provincia de Buenos Aires, Argentina.

Workshop; Workshop de la Sociedad Argentina de Biofisica; 2007

Sociedad Argentina de Biofisica

El plegado y estabilidad son fundamentales para la actividad biologica de las proteinas. Sin embargo, los factores que influyen en la estabilidad no estan del todo entendidos. CopA es una P-ATPasa termofila de Archaeoglobus fulgidus. En comunicaciones previas mostramos que en presencia de Cloruro de Guanidinio (GndHCl) y Dodecil Sulfato de Sodio (SDS) la fluorescencia de triptofanos (Trp) disminuye reversiblemente. La [¦È]222nm disminuye en presencia de GndHCl de manera reversible mientras que con SDS la [¦È]222nm no se modifica apreciablemente. CopA se inactiva totalmente, en forma reversible, en presencia de GndHCl y SDS, en este último caso, en concentraciones menores a la CMC. El objetivo de este trabajo es estudiar como transcurre la desnaturalizacion quimica de CopA y evaluar como cambia la estructura global de esta proteina. CopA fue expresada en forma heterologa en E. coli, solubilizada en dodecilmaltosido,  purificada por afinidad, y reconstituida en micelas de lipidos-detergente. La enzima purificada retuvo un maximo de actividad ATPasa a 75 grados. Los efectos del GndHCl los estudiamos a traves de experimentos de quenching de Trp por Ioduro de Sodio. Nuestros resultados muestran que en ausencia del desnaturalizante hay una fraccion de Trp expuestos al solvente de 0,36 mientras que en presencia de GndHCl 6 M la fraccion accesible  aumenta a un valor de 0,86. Los efectos del SDS  los evaluamos a traves de geles de SDS-PAGE, y midiendo cambios en el radio hidrodinamico por dispersion de luz. Resultados preliminares indican que el SDS induce una expansion en la proteina que se refleja en un aumento del radio hidrodinamico. El trabajo en su conjunto muestra un proceso de desnaturalizacion reversible con estados desplegados diferentes para cada desnaturalizante. El  GndHCl lleva a un estado final de globulo fundido mientras que en presencia de SDS el estado final parece ser una estructura expandida con persistencia de estructura secundaria. Experimentos de dispersion de luz permitiran evaluar cambios de volumen en CopA. Por otro lado, disponemos de mutantes puntuales de cisteinas tanto en las regiones solubles como en las transmembranicas, las cuales nos permitiran estudiar cambios en regiones puntuales de CopA.