Desarrollo de un sistema de detección de anticuerpos neutralizantes del coronavirus SARS-CoV-2 basado en la técnica de ELISA

MILITELLO, DA; PAVAN, MF; IBAÑEZ, LI

Vaquerías Códoba

Workshop; XLIII Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Virología; 2023

SAV

En diciembre de 2019, se detectó un nuevo coronavirus, síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2), en Wuhan, China. Es un virus de ARN, que pertenece a la familia de los β-coronavirus. La proteína Spike es una de las cuatro proteínas estructurales principales que cubren la superficie de cada virión, y es responsable de la entrada en la célula huésped. Presenta dos dominios, S1 y S2, que desempeñan funciones importantes en la unión al receptor y la fusión de membranas. Dentro del dominio S1 N-terminal se encuentra el dominio de unión al receptor, RBD. Este dominio se une al receptor, la enzima convertidora de angiotensina humana tipo 2 (hACE2) de la célula huésped e inicia la infección viral. Generalmente, las pruebas serológicas para la detección de personas infectadas se basan en la detección de anticuerpos con capacidad de unirse a Spike o la nucleoproteína N, del SARS-CoV-2, pero no permiten identificar anticuerpos neutralizantes, esenciales para combatir la infección. Las técnicas para medir estos anticuerpos son costosas y complejas. Considerando la importancia de determinar los niveles de anticuerpos neutralizantes luego de una infección o de la vacunación, el objetivo general del proyecto es generar un sistema simple y económico que permita la determinación de anticuerpos neutralizantes de la infección causada por SARS-CoV-2. Para esto, se generaron dos construcciones. Primero se clonó la secuencia de la proteína ACE2 sin la región transmembrana (TM) en un vector de expresión para obtener la misma de manera soluble. Por otro lado, la secuencia codificante de RBD se clonó en un vector que contenía la secuencia codificante para HRP. Ambas construcciones contenían señales de secreción que permiten su purificación desde el sobrenadante de células transfectadas. Para el ensayo de ELISA, se inmovilizó ACE2, se incubó con diferentes diluciones de plasma o suero de llamas, ratones y humanos. Por último, se agregó RBD conjugada a HRP y luego de los lavados, el sustrato colorimétrico TMB. Pudimos observar que es posible detectar la presencia de anticuerpos que bloquean la interacción RBD-ACE2s mediante una disminución en la señal observada, la cual fue dependiente de la concentración de anticuerpos presentes. Por otro lado, fue posible también realizar determinaciones similares utilizando RBD de variantes del virus. En conclusión, logramos desarrollar un sistema efectivo para la detección de anticuerpos neutralizantes contra el SARS-CoV-2. Nuestros resultados en el ensayo de ELISA mostraron coherencia con otras técnicas de detección. Este sistema no solo es altamente preciso sino también más accesible y económico y puede ser de gran valor para la selección de donantes para las terapias con plasma de convalecientes, para evaluar la eficacia de la vacuna durante los ensayos preclínicos y clínicos de diferentes vacunas candidatas y para controlar los títulos neutralizantes en las personas vacunadas o infectadas.