Desarrollo de un kit diagnóstico de ELISA basado en nanoanticuerpos para la detección de norovirus humano

BRACCO, L; IBAÑEZ, LI; GOMES, K; PARREÑO, V; BOK, M

Vaquerías Códoba

Workshop; XLIII Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Virología; 2023

SAV

Los Norovirus humanos (HuNoV) son la causa del 95% de las epidemias de gastroenteritis no bacterianas a nivel global. La infección por HuNoV generalmente se diagnostica mediante qPCR, ya que los ELISA y las inmunocromatografías disponibles comercialmente poseen baja sensibilidad y solo pueden detectar algunos genotipos. En los países en vía de desarrollo, los métodos moleculares sólo están disponibles en centros de referencia y con fines epidemiológicos. Así, las unidades centinela y las salas de primeros auxilios no cuentan con una prueba rápida para la detección temprana de brotes. El objetivo de este estudio fue desarrollar un kit de diagnóstico basado en nanoanticuerpos (Nb) para la detección de HuNoV GI, GII y GIV, con alta sensibilidad y especificidad. Se seleccionaron Nb de HuNoV contra los genotipos GI, GII y GIV a partir de bibliotecas inmunes derivadas de llamas. Se utilizaron versiones bivalentes de tres clones de Nb (N1 específico contra GI, M5 específico contra GII y A12 específico contra GIV) para sensibilizar las placas de ELISA. Otros clones (N2 específico contra GI, C8.5 específico contra GII y B8 específico contra GIV) fueron fusionados con peroxidasa de rábano picante (HRP) utilizando dos estrategias diferentes: i) formación de enlace covalente entre HRP y los Nb expresados en E. coli y ii) expresión de proteínas de fusión en células de mamíferos. Por otro lado, las virus-like particles (VLPs) de GI, GII y GIV se expresaron en sistema de baculovirus para usarlas como controles positivos en la optimización del ELISA. Además, se obtuvieron muestras fecales positivas y negativas del Instituto Malbrán, Argentina, durante 2018 y se almacenaron a -80°C. De las dos estrategias de marcación con HRP, la expresión de proteínas de fusión Nb-HRP dio los mejores resultados al reducir el background del ensayo. Como resultados preliminares, los tres Nb bivalentes (500 ng/pocillo cada uno) combinados con los tres Nb-HRP detectaron entre 1 y 10 ng de cada VLP analizada (GI.1 Norwalk, GII.4 MD-2004 y GIV St. Cloud). De un total de 5 muestras de materia fecal positivas para GII-qPCR, 4 dieron positivas con el Nb-ELISA. De un total de 8 muestras de materia fecal positivas para GI-qPCR, 2 dieron positivas con el Nb-ELISA. Además, al comparar con un kit inmunocromatográfico disponible comercialmente, de 5 muestras de materia fecal positivas para GII, 4 fueron diagnosticadas positivas mediante el Nb-ELISA. Por el contrario, de 5 muestras de materia fecal positivas para GI, 2 fueron diagnosticadas positivas mediante el Nb-ELISA. Desarrollamos con éxito un ensayo ELISA basado en Nb para detectar HuNoV en muestras fecales. Las condiciones de almacenamiento de las muestras y los ciclos de congelación y descongelación podrían ser factores críticos para aumentar las tasas de detección. Se analizarán nuevas muestras frescas y se realizará una validación analítica más exhaustiva, además de una validación diagnóstica del ensayo.