Generación de nanoanticuerpos para la detección de las cepas del virus de papa Potato Virus Y

MORA-ALVARADO, E; BOK M; PARREÑO V; IBAÑEZ LI; GUDESBLA GE

Vaquerías Códoba

Workshop; Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Virología; 2023

SAV

La papa es un alimento tradicional en nuestro país, se consumen aproximadamente 60 kg/cápita/año. Los principales virus que afectan a este cultivo son el virus de la papa Y (PVY), el virus de la papa X (PVX), y el virus del enrollamiento de la hoja de la papa (PLRV). PVY es un virus que posee un genoma de ARN de cadena simple de unos 10 kb, infecta principalmente a solanáceas. En Argentina se ha descrito la coexistencia principalmente de las cepas PVYN, que produce necrosis en las nervaduras, y PVYO, que induce el síntoma en forma de mosaico, ambas cepas poseen un 94% de identidad aminoacídica. El virus se disemina en el campo por medio de áfidos, un insecto vector que adquiere el virus al alimentarse de una planta y lo transmite a otras. Se calcula que las pérdidas de rendimiento causadas por este virus en las regiones productoras del país pueden llegar del 10 al 80%. El SENASA establece la obligación a los productores de papa semilla la detección de PVY. Actualmente las pruebas de detección se realizan mediante kits de ELISA importados, a través de la inmunodetección de la proteína de la cápside (CP) del virus con anticuerpos policlonales o monoclonales.Los nanoanticuerpos (NAcs) se producen a partir de las regiones variables de un tipo especial de inmunoglobulinas de camélidos. Son de tamaño pequeño (alrededor de 15 kDa), poseen una alta sensibilidad y afinidad. Dado que pueden fusionarse genéticamente con diversas proteínas, pueden utilizarse para reemplazar los anticuerpos convencionales en sistemas de detección, reduciendo su costo.Este trabajo tiene como objetivo generar NAcs capaces de reconocer a la proteína CP de las dos cepas de PVY mencionadas previamente, para ser utilizados en el desarrollo de sistemas de inmunodiagnóstico.Para la expresión de la proteína CP de ambas cepas, se transformaron bacterias Escherichia coli BL21 y WK6 con el vector de expresión pET28 que contiene el inserto de la proteína de la cápside fusionado a un tag de histidinas para facilitar su purificación. Las condiciones de expresión se pusieron a punto variando las condiciones de temperatura, tiempo de inducción y concentración del inductor IPTG. Para la extracción de las proteínas se lisaron las células por sonicado. Restos celulares y proteínas insolubles fueron removidas por centrifugación. Dado que CP forma VLP (Virus like particles), el sobrenadante fue resuspendido en PBS y precipitado con PEG 6000, seguido de la purificación de las proteínas usando resina Ni-NTA. El rendimiento total de CP fue de 1.6 mg/L. Se realizaron 5 inmunizaciones a una llama con intervalos de 15 días y se obtuvo un tamaño de biblioteca de 8x107 colonias. Por técnicas de bio-panning, se seleccionaron 50 clones específicos capaces de reconocer a ambas cepas de PVY.