Purificación de una fitoproteasa cisteínica y aplicación a la síntesis de péptidos

BARBERIS S; QUIROGA E; NAVIGATORE FONZO L; ARRIBERE M; PRIOLO N

Perú

Congreso; Primer congreso internacional fito-2000 . primer congreso peruano de plantas medicinales y fitoterapia; 2000

Instituto de Fitoterapia Americano (Perú)

Introducción:  en la última década, la enzimología no acuosa ha recibido considerable atención.  Las enzimas en medios orgánicos permiten aumentar las aplicaciones de las mismas como catalizadores de procesos.  El objetivo de este trabajo es estudiar el comportamiento de una fracción purificada (Fracción I) de una fitoproteasa de Araujiana hortorum en la síntesis enzimática de péptidos, en medios bifásicos.             Metodología:  El látex del fruto de Araujiaina hortorum fue recogido sobre buffer citrato-fosfato 0,1 M (pH: 6,5) conteniendo EDTA y cisteína (5 mM), centrifugado a 16.000 x g durante 30 minutos , a 4°C.  Gomas y materiales insolubles fueron descartados y el sobrenadante fue centrifugado a 100.000 x g durante 60 min, a 4° C.  Este nuevo sobrenadante (extracto crudo), conteniendo proteínas solubles fue conservado a –20°C. La purificación de los principales componentes proteolíticos fue llevada a cabo mediante cromatografía de intercambio catiónico (CM Sepharose CL-6B Fast Flow).  Se cargaron 40 ml de extracto crudo, conteniendo 75 mg de proteína, a una columna Pharmacia K (15/30), se agregaron 60 ml de buffer citrato-fosfato 55 mM (pH:  6,4) y se eluyó la misma mediante un gradiente de cloruro de sodio (0-0,6 M) en el mismo buffer.             Resultados y Discusión:  Se trabajó en un sistema bifásico, consistente en una fase acuosa (buffer ácido bórico-NaOH, pH: 8), conteniendo la enzima, 2-mercaptoetanol) y Phe-OCH3 y una fase orgánica (n-hexano), conteniendo un CBZ-Aminoácido (Glu, Ala, Asp).  La reacción fue llevada a cabo a T (°C) ambiente, a 200 rpm.  Los derivados de Ala y Glu dieron orígen a dos productos (tR =  5,3 y 4,83)  que fueron identificados por HPLC-EM.